مشخص شده که تیمول و کارواکرول با فشار هیدرو استاتیک بالا یک اثر سینرژیستی دارند. تعداد سلول‌های زنده لیستریا مونو سایتوژنز که در فاز لگاریتمی کاهش یافت، با فرایند ترکیب شده با MPa۳۰۰ فشار هیدرو استاتیک و ۳ میلی مول بر لیتر تیمول یا کارواکرول بیشتر بود نسبت به حالتی که هر فرایند به طور مجزا انجام گرفت. از آنجایی که باور بر این است که فشار هیدرو استاتیک بالا باعث نابودی لایه سلول می‌شود می‌توان نتیجه گرفت که این مکانیسم مشترک اساس سینرژیسم مشاهده شده است .(Carson et al, 2002)
فعالیت ضد میکروبی اسانس‌ها هم چنین می‌تواند توسط میزان اکسیژن در دسترس تحت تأثیر قرار بگیرد. این می‌تواند به این علت بشد که زمانی که اکسیژن کم است تغییرات اکسیداتیو کمتر در اسانس‌ها رخ می‌دهد یا اینکه سلول‌های باکتری‌ها انرژی‌شان را از طریق متابولیسم غیر هوازی کسب می‌کنند به فعالیت توکسیک اسانس‌ها بیشتر حساس می‌شوند. فعالیت ضد باکتری اسانس‌های پونه کوهی و آویشن معمولاً در اکسیژن پایین بر علیه سالمونلا تیفی موریوم و استافیلوکوکوس اورئوس افزایش می‌یابد. استفاده از بسته بندی و وکیوم در ترکیب با اسانس پونه کوهی، یک اثر سینرژیستی روی بازدارندگی لیستریا مونوسایتوژنز و فلور فاسد کننده در گوشت دارد. مشخص شد که اسانس پونه کوهی در گوشت قیمه و بسته بندی شده با اتمسفر اصلاح شده (۴۰ درصد دی اکسید کربن،۳۰ درصد نیتروژن و۳۰ درصد اکسیژن) در قیاس با گوشت بسته بندی شده با اتمسفر معمولی رشد میکروبی را به تأخیر می‌اندازد و شمارش نهایی میکروارگانیسم های عامل فساد را کاهش می‌دهد .(Ultee et al, 2000)
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- مقدمه
در این فصل به بررسی مواد و روش انجام آزمایشات مورد استفاده در انجام طرح مورد نظر می پردازیم و هر یک از آن ها بطور جداگانه توضیح خواهیم داد.
۳-۲- نوع مطالعه
پایه (تجربی): بر اساس مطالعات آزمایشگاهی
۳-۳- جمع آوری و آماده سازی گیاه
به علت شرایط زمانی انجام پایان نامه، گیاه کهلیک اوتی از عطاری های شهرستان تبریز بصورت خشک شده و کامل تهیه شد و سپس نام علمی توسط هرباریوم دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تبریز تایید گردید.
۳-۴- تهیه اسانس
جهت تهیه اسانس گیاه کهلیک اوتی، ۲۰۰گرم گیاه خشک را خرد و آسیاب و سپس با بهره گرفتن از یک دستگاه کلونجر اسانس روغنی و فرار گیاه به روش تقطیر با آب استخراج گردید. اسانس بدست آمده به کمک سولفات سدیم خشک، آبگیری و پس از عبور از میکروفیلترμm 45/0 در ظرف شیشه ای تیره به دور از نور خورشید در دمای ۴ درجه سانتیگراد تا زمان شناسایی و تعیین ترکیبات شیمیایی، تعیین خواص ضد باکتریایی و آنتی اکسیدانی نگه داری شد .(Sefidkon and Rahimi Bidgoli, 2002)
۳-۵- تعیین ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه کهلیک اوتی
مواد و وسایل لازم: دستگاه کروماتوگرافی گازی، دستگاه کروماتوگرافی متصل به طیف نگار جرمی و اسانس گیاه
ابتدا نمونه آماده شده اسانس به دستگاه کروماتوگرافی گازی۱ تزریق شد و مناسب ترین برنامه ریزی دمایی ستون برای جداسازی کامل ترکیبات اسانس بدست آورده شد. سپس اسانس به دستگاه گاز کروماتوگرافی متصل به طیف نگار۲ جرمی نیز تزریق شده و طیف جرمی ترکیب ها را بدست آوردیم و با بهره گرفتن از شاخص بازداری، بررسی طیف های جرمی و مقایسه آن ها با طیف های مرجع شناسایی هر یک از اجزای اسانس انجام شد .(Adams, 2001) در این مطالعه دستگاه GC-MS از نوع Agilent6890 با ستون مویینه به طول ۳۰ متر، قطر داخلی ۲۵/۰ میلیمتر و ضخامت لایه داخلی ۲۵/۰ میکرومتر از نوع HP-5MS با برنامه دمایی ستون در ابتدا بصورت ۷۰ درجه سانتیگراد با توقف ۲ دقیقه در این دما سپس افزایش دما تا ۲۲۰ درجه سانتیگراد با سرعت ۱۵ درجه در هر دقیقه، و افزایش دمای ستون تا ۳۰۰ درجه سانتیگراد به مدت ۲ دقیقه استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
شکل ۳-۱ تصویری از دستگاGC-MS
۱ Gas chromatograPhy
۲ Gas ChromatograPhy/ Mass SpectroPhotometer
۳-۶- ارزیابی ترکیبات فنولیک
مواد و وسایل لازم: اسید گالیک، محلول فولین، آب مقطر، محلول کربنات سدیم، لوله آزمایش، پیپت و دستگاه اسپکتروفوتومتر
سنجش مواد فنولیک تام با بهره گرفتن از واکنشگر فولین سیوکالتو )سیگما آلدریچ[۴۰] ( و اسید گالیک به عنوان استاندارد انجام می شود .(Dapkevicius et al, 1998)1/0 میلی لیتر از اسانس مذکور را در ارلن ریخته و ۴۶ میلی لیتر آب مقطر و ۱ میلی لیتر واکنشگر فولین سیوکالتو به آن اضافه کردیم، سپس محتویات ارلن مایر به شدت مخلوط و بعد از ۳ دقیقه، ۳ میلی لیتر از محلول کربنات سدیم ۲% اضافه کرده و محلول را به مدت ۲ ساعت روی صفحه تکان دهنده با شدت متوسط قرار دادیم و سپس جذب آن در nm 760 به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. عملیات انجام شده در بالا را برای محلول های استاندارد اسید گالیک (۱۰۰۰-۰ میکرو گرم در ۱/۰ میلی لیتر) هم انجام دادیم و منحنی استاندارد آن را رسم و بر اساس آن غلظت مواد فنولیک را محاسبه و بر حسب میکرو گرم اسید گالیک بر میلی لیتر اسانس بیان کردیم.
شکل ۳-۲ تصویری از یک دستگاه اسپکتروفوتومتر
۳-۷- میزان فلاونوییدها
مواد و وسایل مورد نیاز: محلول کلرید آلومینیوم، کوئرسیتین، لوله آزمایش، پیپت و دستگاه اسپکتروفوتومتر
جهت اندازه گیری محتوی فلاونوییدی اسانس گیاه، ابتدا غلظت های مختلفی از اسانس را تهیه و مقدار ۵۰۰ میکرولیتر از هر غلظت را در لوله آزمایش ریختیم و به هر لوله ۵۰۰ میکرولیتر محلول کلریدآلومینیوم ۲% حل شده در اتانول اضافه و لوله ها را به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار دادیم و سپس جذب محلول ها را در ۴۲۰ nm توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه گیری کردیم .(Mikkonen et al, 2001)با بهره گرفتن از همین روش منحنی استاندارد کوئرسیتین در محدوده ۵ تا ۶۰ میلی گرم بر میلی لیتر کوئرستین رسم کردیم و مقدار کل ترکیبات فلاونوئید اسانس گیاه را برحسب میکرو گرم کوئرسیتین بر میلی لیتر اسانس گیاهی محاسبه کردیم.
۳-۸- بررسی خواص آنتی اکسیدانی اسانس با روش DPPH
مواد و وسایل مورد نیاز: محلول متانولی DPPH، بوتیلیتد هیدروکسی تولوئن، ارلن و دستگاه اسپکتروفوتومتر
ارزیابی توانایی هیدروژن دهندگی عصاره ها و اسانس ها، به واسطه بی رنگ نمودن محلول متانولی ارغوانی رنگ
[۴۱]DPPH اندازه گیری شد (Burits and Bucar, 2000). در این ارزیابی طیف سنجی، از رادیکال پایدار دی فنیل پیکریل هیدرازیل به عنوان عامل واکنش دهنده استفاده می شود. روش کار بدین صورت بود که ۵۰ میکرولیتر از غلظت های مختلف اسانس به ۵ میلی لیتر محلول متانولی۰۰۴/۰ درصد DPPH افزوده شد و بعد از ۳۰ دقیقه نگه داری در دمای اتاق، جذب در طول موج nm 517 در مقایسه با شاهد قرائت شد.
بازداری رادیکالی آزاد DPPH بر اساس درصد) %(I به صورت زیرمحاسبه می شود:
فرمول ۳-۱: I% = (Ablank – Asample / A blank) × ۱۰۰
که Ablank جذب محلول شاهد (حاوی همه مواد واکنشگر به جز اسانس ) و Asampleجذب محلول حاوی غلظت های مختلف اسانس است. آنتی اکسیدان سنتزی BHT نیز به عنوان کنترل مثبت به کار می رود آزمایشات در ۳ تکرار انجام شد و میانگین آن ها بعنوان عدد مورد نظر اعلام شد.
۳-۹- خصوصیات ضدمیکروبی و بهداشتی اسانس علیه باکتری E.coli O157:H7
مواد و وسایل مورد نیاز: شیر، محیط کشت آبگوشت قلب ومغز (BHI)، محیط کشت EMB، کشت لیوفیلیزه E.coli O157:H7، استارتر، پیپت پاستور، میکروپلیت، میکرو تیوپ، سر سمپلر زرد و آبی، لوله فالکول، ظروف شیشه ای درب دار، پیپت، پلیت های کشت، بالن های شیشه ای، دستگاه شیکر، هیتر و آون
ارزیابی حداقل غلظت ممانعت کننده رشد[۴۲]MIC تحت شرایط دمایی ثابت روی باکتری E.coli O157:H7، به روش گولوس و همکاران انجام شد .(Gulluce et al, 2007) روش میکروبیولوژی، روش تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد با بهره گرفتن از پلات‌های ٩۶ خانه می‌باشد. تعیین MIC در این روش بر پایه مشاهده چشمی یا تشخیص کدورت با بهره گرفتن از جذب نوری توسط دستگاه Plate Reader می‌باشد. ابتدا کشت باکتریایی در محیط آبگوشت قلب ومغز به مدت ۱۲ ساعت انجام شد و برای افزایش حلالیت و گسترش یکنواخت اسانس در محیط کشت از دی متیل سولفوکساید ۵ درصد به عنوان امولسیفایر و آگار آگار به میزان ۰۵/۰ درصد (به عنوان پایدار کننده) استفاده گردید.
بطوری که در هر چاهک ۸۰ میکرولیتر محیط کشت آبگوشت BHI[43] استریل، ۱۰۰ میکرولیتر از رقت های متوالی اسانس مورد مطالعه و در نهایت ۲۰ میکرولیتر کشت باکتریایی که حاوی حدود cfu/ml 105 از باکتری E.coli O157:H7 است اضافه شد. در ادامه میکروپلیت ها بمدت ۲۰ ثانیه با دور rpm300 شیک شده و در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد بمدت ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری شدند. پس از پایان زمان انکوباسیون مقدار MIC بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر محاسبه گردید. حداقل غلظتی که ایجاد حالت عدم رشد یا عدم کدورت مشهود در مقایسه با گروه کنترل کند بعنوان MIC تعیین گردید.
جهت بررسی خاصیت ضد میکروبی در مدل غذایی دوغ، ابتدا دوغ را با روش زیر تهیه کردیم:
شیر پاستوریزه را حرارت داده تا دمایش به ۴۳ درجه سانتی گراد افزایش یافت و در این دما ۲ درصد استارتر شامل باکتری های استرپتوکوکوس ترموفیلوس، لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و گونه های مختلف لاکتوباسیلوس و کمتر از ۱ درصد نمک اضافه کرده در دمای ۴۲ درجه سانتی گراد تا رسیدن به ۶/۴ =Ph گرم خانه گذاری شد .(Simsek et al, 2007) دوغ حاصل به ۶ بچ جداگانه تقسیم و به هر یک از بچ ها تعداد cfu/ml105 باکتری مورد آزمایش از قبل آماده شده اضافه گردید. سپس غلظت های صفر، ۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰ و ۵۰۰ ppm از اسانس را اضافه به مدت دو هفته در شرایط یخچالی نگه داری و طی روزهای یک، سه، پنج، هفت، ده و چهارده از لحاظ خصوصیات باکتریایی یعنی ماندگاری اشرشیا مورد ارزیابی قرار داده شد (هر کدام از تیمارها در سه تکرار انجام شد). شمارش E.coli O157:H7 در محیط کشت ائوزین متیلن بلو آگار و با روش کشت سطحی انجام شد (Aligiannis et al, 2001).
۳-۱۰- ارزیابی خصوصیات حسی
برای ارزیابی ویژگی های حسی ناشی از افزودن اسانس کهلیک اوتی به دوغ از آزمون پذیرش حسی[۴۴] استفاده گردید. برای این منظور دوغ آماده شده به شش قسمت (شامل ۵۰۰ میلی لیتر دوغ در فلاسک ها با حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر) تقسیم شد، سپس اسانس مورد مطالعه در غلظت های مورد مطالعه به هر فلاسک اضافه شد. ارزیابی حسی بوسیله یک پانل پنج نفره صورت پذیرفت. اعضای پانل معیار خود از ارزیابی حسی دوغ حاوی اسانس را با بهره گرفتن از یک مقیاس حسی ۹ نمره ای[۴۵] مشخص نمودند .(Meilgaard et al, 1999)
در این مقیاس نمره ۹ خیلی عالی، نمره ۸ عالی، نمره ۷ خوب، نمره ۶ نسبتاً خوب، نمره ۵ نه خوب نه بد، نمره ۴ نسبتاً بد، نمره ۳ بد، نمره ۲ خیلی بد و نهایتاً نمره ۱ فوق العاده بد، برای ارزیابی ویژگی های حسی لحاظ گردید.
۳-۱۱- آنالیز فیزیکوشیمیایی
برای هر یک از بچ های دوغ حاوی غلظت های صفر، ۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰، ۵۰۰ ppm اسانس نگه داری شده در دمای یخچالی، در روزهای یک، سه، پنج، هفت، ده و چهارده آزمایشات زیر را انجام می دهیم :
مواد و وسایل مورد نیاز: آب مقطر، محلول بافری، هیدروکسید سدیم ۱/۰، معرف فنول فتالئین، اسید سولفوریک ۸۴ درصد، الکل ایزوآمیلیک، پیپت، Ph متر، بورت، ارلن، بوته چینی، بوتیرومتر، بن ماری و شعله
۳-۱۱-۱-Ph: دوغ با یک Ph متر دیجیتالی مجهز به یک الکترود استاندارد شیشه ای اندازه گیری شد.Ph متر قبل از استفاده ابتدا با محلول های بافری با Ph 9 و۴ کالیبره شد (استاندارد ملی ایران، ۱۳۸۷).
۳-۱۱-۲- اسیدیته قابل تیتراسیون[۴۶]: دوغ با مخلوط کردن ۲۵ میلی لیتر دوغ با ۱۰ میلی لیتر آب مقطر و تیتراسیون با سود ۱/۰ نرمال انجام شد و سپس با قرار دادن مقدار سود مصرفی در فرمول زیر اسیدیته بر حسب درصد اسید لاکتیک محاسبه شد .(Simsek, Sagdic and Ozcelik, 2007)
فرمول ۳-۲:
اسیدیته بر حسب درصد اسید لاکتیک=(میلی لیتر سود مصرفی×۱۰۰×۰۰۹/۰)/(وزن نمونه بر حسب گرم)
