استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر می­باشد (Newton CR et al, 1995).
۳-۴ استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP
۱- ۵ میکرولیتر پروتئاز را روی ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت ۱۰ ثانیه ورتکس می­کنیم سپس لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه درون Hot plate در دمای۷۲ درجه سانتیگراد قرار می­دهیم.
۲- بعد از بیرون آوردن لوله ها از Hot plate در دمای۷۲ درجه، ۴۰۰ میکرولیترLysis Solution ریخته و به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه ورتکس می­کنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید.
۳- به محلول فوق ۳۰۰ میکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای ۵ ثانیه ورتکس می­کنیم، سپس لوله ها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت ۱۰ دقیقه قرار می­دهیم.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۴- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی لوله ها را خالی کرده و لوله ها را روی یک دستمال به مدت ۳-۲ ثانیه قرار می­دهیم.
۵- لوله ها را برگردانده و به هر کدام ۱ میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت ۵-۳ ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این بار به مدت ۵ دقیقه قرار می­دهیم.
۶- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته لوله را نگه داشته و برای اینکه Wash Buffer درون لوله ها کاملا خشک شود آن ها را به مدت ۵ دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار می­دهیم.
۷- بعد از خشک شدن لوله ها آن ها را بیرون آورده و ۳۰ میکرولیتر از Solvent Buffer اضافه کرده لوله ها را به آرامی تکان می­دهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار می­دهیم به مدت ۵ دقیقه تا رسوب ته لوله که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم.
۳-۵ PCR
از واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپ­های چند­شکلی ژنتیکی ژن­هایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد بیرون می­آوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آن­ها را روی یخ قرار می دهیم. جهت تهیه ۲۰ میکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرلوله، مواد مورد نیاز را طبق جدول ۳-۲ با هم مخلوط می­کنیم.
جدول ۳-۲: مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR