سانتریفوژ باکتری ها در دمای ۴ درجه سانتی گراد، به مدت ۲۰ دقیقه و در ۹۰۰۰rpm توسط سانتریفوژ یخچال دارانجام شد.به این ترتیب پروتئین های محلول از اجزای غیر محلول باکتری جدا گردید.
محلول رویی جهت خروج کامل مواد نامحلول از فیلتر ۰٫۴mm عبور داده شد.
ب) آماده سازی و به تعادل رساندن رزین:
-
-
-
- پس از تکان دادن آرام محلول رزین، مقدار۲ml رزین تازه (که حاوی یک میلی لیتر رزین خشک در ۱ml محلول نگهدارنده است)برداشته شدو در یک اپندورف قرار گرفت.این مقدار رزین برای تخلیص ۱ لیتر محیط کشت حاوی پروتئین کافی است.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
-
-
-
- رزین فوق به آرامی به مدت ۳۰ ثانیه ودر ۱۰۰۰rpm سانتریفوژ شد.
-
- محلول رویی دور ریخته شد و هم حجم آن آب دیونیزه اضافه گردید،سپس به آرامی پی پتاژ صورت گرفت و مجددا سانتریفوژ مطابق مرحله ۸ انجام گرفت.
-
- برای اطمینان از خروج کامل ماده نگهدارنده می توان مرحله ۹ را تکرار کرد ،سپس رزین به ستون کروماتوگرافی منتقل شد.
-
- پس از خروج کامل آب مقطر از انتهای ستون، مقدار۱۰ml (10 برابر حجم رزین خشک) بافر تعادل(اتصال)به رزین افزوده شد و پس از پی پتاژ آرام برای درگیر کردن همه بیدهای رزین، اجازه داده شد تا این محلول به آرامی از انتهای ستون خارج شود.این امر باعث کاهش پیوندهای غیراختصاصی می شود.
ج) مجاورت نمونه و رزین:
-
- رزین پس از به تعادل رسانی از ستون خارج شده و به آرامی به محتویات فالکون ها از مرحله ۶ افزوده شد.سپس به مدت ۱ ساعت روی یخ و به آرامی شیک شد. با این کار به پروتئین مورد نظر فرصت کافی برای اتصال به بیدهای رزین داده می شود.
-
- محتویات فالکون ها که حاوی کشت باکتری و رزین می باشد پس از ۱ ساعت به آرامی داخل ستون ریخته شد، به این ترتیب پروتئین های متصل نشده به رزین از ستون خارج شدند. محلول زیری خارج شده (FT)(Flow-through) جمع آوری شد.
د) شستشوی رزین:
-
- ستون به طور متناوب با ۵ml (5برابر حجم رزین خشک)از هر یک از بافرهای چهارگانه شستشو، شسته می شود و محلول عبوری زیری از هرکدام از محلول ها(تحت عنوان W1-W4)در فراکش های ۰٫۵-۱ml جمع آوری می شود.در این حالت با زیادشدن غلظت ایمیدازول ،به تدریج اتصالات سست یا غیر اختصاصی پروتئین های مزاحم جدا شده و خارج می گردند.
ه) جداسازی پروتئین از رزین:
-
- در نهایت شستشوی ستون با۵ml بافر جدا کننده انجام گرفت.در این شرایط قوی ترین باندهای متصله از ستون جدا شده و خارج می گردند.فراکشن ها ترجیحا ۰٫۵ml (تحت نام E)جمع آوری می شوند.
و) جمع آوری رزین:
-
- به منظور اطمینان از خروج کامل پروتئین ها ،رزین چندبار با بافر جداکننده شستشو شد.
-
- هم حجم رزین آب مقطر افزوده شد و با معلق سازی به کمک آن رزین از ستون خارج گردید و در یک اپندورف ریخته شد.
-
- سانتریفوژ رزین به مدت۳۰ ثانیه و ۱۰۰۰rpm انجام گردید،سپس آب مقطر از روی آن برداشته شد.
-
- هم حجم رزین اتانول ۲۵ درصد افزوده شد و در یخچال قرار گرفت.
ز)بازیابی ستون از پروتئین های مزاحم:
-
- سانتریفوژ رزین به مدت ۳۰ ثانیه و ۱۰۰۰rpm برای خروج الکل انجام شد.
-
- رزین ۳-۲ بار با آب مقطر شسته شد سپس داخل ستون ریخته شد.
-
- پس از خروج کامل آب مقطر از انتهای ستون،رزین با عبور مداوم(به مدت۳۰ ثانیه)NaOH (0.5m)کاملا شسته شد.
ح)شارژ رزین:
-
- شتشوی رزین با آب مقطر برای حذف کامل مواد نگهدارنده و یا NaOH چندین بار انجام گرفت.
-
- پس از سانتریفوژ و خروج کامل آب مقطر محلول ۰٫۵M NiSO4 به رزین خشک افزوده شد و به آرامی شیک شد.این کار تا تغییر رنگ رزین(از سفید به سبز-آبی) ادامه یافت.
-
- محلول NiSO4 با سانتریفوژ از رزین خارج گردید سپس برای خروج کامل NiSO4 ،رزین چندین بار با آب مقطر شسته شد.
*محیط کشت باکتری پس از افزودن لیزوزیم می تواند در یخچال نیز انکوبه شود اما از آنجا که لیزوزیم در دمای اتاق بهتر عمل می کند انکوباسیون در اتاق صورت گرفت.
*معمولا برای هر لیتر محیط کشت باکتری یک قرص مهارکننده پروتئاز استفاده می شود. به جای استفاده مستقیم از آن می توان یک قرص را در PBS 1ml حل کرده و به هر فالکون ۲۵۰µl افزود.
*کلیه محلول های تخلیص اعم از بافر اتصال ،شستشو و بافر شویش دارای pH=8 می باشند.
*کلیه بافرها در هنگام استفاده باید سرد باشند،لذا در یخچال نگهداری می شوند.
*نمونه های برداشته شده در مراحل مختلف توسط روش SDS-PAGE بررسی شدند.
*از رزینNi-NTA می توان چندین بار جهت تخلیص استفاده نمود،چنانچه رزین تنها برای تخلیص یک نوع پروتئین استفاده شود نیازی به فرایند بازیابی ندارند.
*دشارژ شدن رزین بعد از مدت طولانی و با تغییر رنگ آن(از آبی به سفید تا خاکستری) مشخص می شود، لذا هر بار نیاز به پروسه شارز رزین وجود ندارد.
*چنانچه رزین آلوده شده باشد رنگ آن به قهوه ای روشن متمایل خواهد شد.
