سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته : برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
در این مرحله ۲۵۰ میکرولیتر از بافر محلول کننده[۴۲] که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
۲۵۰ میکرولیتر از محلول لیزکننده[۴۳] به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را ۴ تا ۶ بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
در مرحله ی بعد ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده[۴۴] به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم. سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سروته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
سپس به مدت ۵ دقیقه در ۹۰۰۰ دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم. این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
ستون حاوی محلول را به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
محلول روئی را دور می ریزیم.
به ستون ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو[۴۵] اضافه می کنیم.
به مدت ۴۵ ثانیه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم.
مرحله قبل را یکبار دیگر تکرار می کنیم.
محلول درون ستون را دور می ریزیم.
ستون را به مدت ۱ دقیقه دیگر در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
ستون را درون یک میکروتیوب ۵/۱ قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده[۴۶] را به میزان ۵۰ میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم. بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. ۲ الی ۳ دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
به مدت ۲ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را در درون میکروتیوب ۵/۱ سانتریفیوژ می کنیم.
ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۴-۵ تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید AMP–pBSK که حاوی ژن CD166 سنتز شده توسط کمپانی می باشد ، با توجه به جایگاه های آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه[۴۷] جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات موردنظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
۳-۴-۵-۱ هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
ابتدا بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های Ncol و Xhol را به کمک سایت شرکت تولید کننده یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم. بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافر ۲x تنگو می باشد.
یک میکروتیوب ۲/۰ برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم.
آب استریل : ۱۲ میکرولیتر
بافر تنگو ۲x : 4 میکرولیتر
آنزیم Ncol : 1 میکرولیتر
آنزیم Xhol : 1 میکرولیتر
پلاسمید : ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش : ۲ میکرولیتر
میکروتیوب را به مدت ۱ الی ۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد (دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها) قرار می دهیم.
۳-۴-۵-۲ الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
۳-۴-۵-۲-۱ تهیه بافر TAE 50x
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم :
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار : ۲۵ میلی لیتر
اسید استیک : ۲۸/۱۴ میلی لیتر
آب استریل : به مقداری که حجم نهایی به ۲۵۰ میلی لیتر برسد.
حجم نهایی : ۲۵ میلی لیتر
نکته : برای اینکه بافر TAE 50x را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم.
۳-۴-۵-۲-۲ تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه از ژل آگارز Low استفاده می کنیم. برای تهیه ی ژل ۵/۱ درصد آگارز ، ۴۵/۰ گرم آگارز را در ۳۰ میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده باشد.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای ۵۰ تا ۶۰ درجه سرد شود ، رنگ کرین ویوئر[۴۸] را به میزان ۲ میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و بعد از مدت ۱۵ دقیقه در دمای محیط ژل کاملا آماده است. این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای ۴ درجه قابل نگه داری است.
۳-۴-۵-۲-۳ Run کردن نمونه
