۰۳/۲

۰۵۲/۰

۴

۰۴۰/۰

۰۲/۲

۰۲۰/۰

۵

۰۷۹/۰

۴۱/۱

۰۵۶/۰

۶

۰۹۳/۰

۶۷/۱

۰۵۶/۰

۴-۲- تخلیص آنزیم لیپاز TTL
۴-۲-۱- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی
به منظور حذف بیشترین تعداد ممکن از پروتئین­های ناخالصی موجود در عصاره سلولی و در ضمن حفظ بیشترین تعداد ممکن از آنزیم TTL، بازه­های زمانی مختلفی (۳۰، ۴۰، ۵۰، ۶۰، ۷۰، ۸۰ دقیقه) برای انجام فرایند رسوب دهی دمایی مورد بررسی قرار گرفت. سپس میزان حذف پروتئین­های ناخالصی در هر نمونه با بکارگیری روش SDS-PAGE نشان داده شد. میزان کل پروتئین­ها در هر چاهک μg 12 بود. SDS-PAGE مربوط به رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی، در بازه­های زمانی مختلف (شکل ۴-۲) نشان می­دهد که پس از ۴۰ دقیقه دمادهی در °C 65 بیشترین میزان حذف پروتئین­های ناخالصی اتفاق افتاده است. از آن­جا که آنزیم TTL مربوط به یک آرکئاباکتر ترموفیل می­باشد، بیان این لیپاز در باکتری E. coli این امکان را فراهم می­نماید که با اعمال تیمار حرارتی برخی از پروتئین­های میزبان را حذف نمود. همچنین در بازه­های زمانی طولانی­تر، حذف بیشتری از ناخالصی­ها دیده نمی­ شود. بنابراین برای به حداقل رساندن اثر منفی حرارت­دهی بر ساختار آنزیم TTL، بهینه زمان رسوب دهی دمایی، ۴۰ دقیقه انتخاب شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل ۴-۲- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی؛
تصویر SDS-PAGE 5/12 %.
۴-۲-۲- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز
آنزیم TTL به کمک ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با تغییر غلظت نمکی به صورت مرحله­ ای، در مرحله M 15/0 نمک سدیم کلرید، جداسازی شد (شکل ۴-۳). تصویر SDS-PAGE مربوطه تخلیص کامل این آنزیم را تأیید نمود (شکل ۴-۴). جدول ۴-۲ مشخصات مخلوط پروتئینی و بازده مراحل مختلف تخلیص آنزیم TTL را نشان می­دهد. در مرحله نهایی تخلیص ۵/۱۶ درصد از میزان اولیه آنزیم باقی مانده است.
شکل ۴-۳- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL.
جدول ۴-۲- مشخصات مراحل تخلیص TTL.

کل محتوای پروتئین
(mg)

واحد آنزیم^[۹۵]
(U)

فعالیت ویژه (U/mg)

بازده
(%)

تخلیص
(مرتبه)

عصاره سلولی

۲۰/۴۵

۶۴۲/۵

۱۲۵/۰

۱۰۰

۲/۳

رسوب­دهی دمایی

۸۳/۱۲

۱۶۶/۵