۲-۳-۲-تهیه سیتوزول بافت کبد و کولون

الف) حدود ۲ میلی لیتر از سوسپانسیون تهیه شده از مرحله قبل در داخل لوله های پلی اتلینی مخصوص اولتراسانتریفوژ (مدل Sorvall Combi plus 80) ریخته شدند. سپس لوله ها در روتور مدل T-865B از نوع Fixed Angle، قرار داده شدند.
ب) بعد از تنظیم درجه حرارت روی ۴ درجه سانتی گراد، زمان یکساعت و سرعت محاسبه شده برای g100000 (معادل ۴۵۰۰۰ دور در دقیقه)، نمونه ها سانتریفوژ شدند. در این مرحله اصولا هسته، غشاء سلول و میتوکندری همراه با میکروزوم رسوب کرده و سیتوزول در محلول رویی قرار می گیرد.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

ج) محلول رویی در حجم های ۱۰۰ میکرولیتر به میکروتیوب های مختلف انتقال داده شد و در فریزر °C 80- نگهداری شد که جهت انجام آزمایشات زیر استفاده گردید:
الف) تعیین مقدار پروتئین سیتوزولی
ب) اندازه گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون S- ترانسفراز سیتوزولی

۲-۳-۲-۱-جداسازی میکروزوم از هموژن بافت کبد

پس از جداسازی سیتوزول، در همان لوله های سانتریفوژ به کمک میله های شیشه ای مخصوص، پلت حاصله را در ۱ میلی لیتر محلول KCl 15/1 درصد حل کرده و سپس با نیروی g100000 (معادل ۴۵۰۰۰ دور در دقیقه) طبق پروتکل قبلی سانتریفوژ می کنیم. در این مرحله در واقع پلت را شستشو می دهیم، بنابراین پس از سانتریفوژ محلول رویی را دور ریخته و مانند مرحله قبل پلت باقیمانده را درنیم میلی لیتر PBS (4/7=pH) حاوی ساکاروز ۲۵ درصد (W/V)و EDTA 1 میلی مولار حل می کنیم. محلول حاصله در بخشهای کوچک به میکروتیوب انتقال داده شد و در فریزر ۸۰- درجه نگهداری شد که جهت انجام آزمایشات زیر استفاده گردید:
الف) تعیین میزان پروتئین میکروزومی
ب) اندازه گیری فعالیت آنزیم سیتوکروم P450 کلاس ۱A1 CYP 1A1))

۲-۳-۳-اندازه گیری میزان پروتئین سیتوزولی به روش برادفورد (۱۸)

برای اندازه گیری پروتئین نمونه، روش‌هایی مانند کجلدال، استفاده از طول موج nm 280، روش کدورت سنجی، روش بیوره، روش لوری و روش برادفورد ابداع شده اند. نکته قابل توجه این است که هر کدام از این روش‌ها معایب و محاسنی دارد که بایستی بر حسب نوع کاری که انجام می دهیم، روش مناسب را انتخاب کنیم. در این روش‌ها روش برادفورد به عنوان روش برتر استفاده شد.
روش برادفورد نسبت به روش‌های دیگر حساس تر، سریع تر، ساده تر و دقیق تر است و برای اندازه گیری پروتئین تا حد میکروگرم بکار می رود. از مزایای دیگر روش برادفورد این است که عوامل مداخله کننده و مزاحم آن کمتر از روش‌های دیگر است و فقط مقادیر بسیار زیاد ^[۶۰]SDS و ترتیون  می توانند تداخل نشان دهند. در صورتی که در روش بیوره، مقادیر کم تریس، آمونیاک، گلیسرول و در روش لوری، پتاسیم، منیزیم، EDTA، تریس، ترکیبات تیول دار و کربوهیدرات ها مزاحمت نشان می دهند.
این روش براساس اندازه گیری پروتئین و پپتید، به کمک ماده رنگ زای کوماسی بریلیانت بلو ۲۵۰G صورت می گیرد که با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر با نور مرئی قابل اندازه‌گیری است. حداکثر جذب نوری معرف رنگی از nm 465 قبل از ترکیب پروتئین به nm 595 بعد از ترکیب تغییر می کند.
- طرز تهیه محلول‌های مورد نیاز
الف) طرز تهیه معرف برادفورد ۵ برابر غلظت (x 5 (
mg 100 کوماسی بریلیانت بلو G-250 [Sigma] در ml 50 اتانول مطلق حل شده، ml 100 اسید فسفریک ۸۵% به آن اضافه شد و حجم نهایی با آب دو بار تقطیر به ml 200 رسانده شد. سپس محلول از کاغذ صافی واتمن شماره ۱ عبور داده شد. محلول حاصل دارای رنگ قرمز تیره بوده و در ۴ درجه سانتی گراد و در ظرف تیره به طور نامحدود پایدار خواهد ماند. در زمان استفاده از محلول برادفورد، ۱ حجم از محلول ذخیره^[۶۱] را با ۴ حجم آب مقطر مخلوط می کنیم ( محلول x 1 (. این محلول آبی-قهوه ای بوده و در ۴ درجه سانتی گراد و در ظرف تیره به مدت ۱ ماه پایدار خواهد ماند.
ب) طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت mg/ml 1000
۵ میلی گرم آلبومین سرم گاوی (BSA) [Sigma] در ۵ میلی لیتر آب مقطر حل شده و استاندارد ذخیره^[۶۲] mg/ml 1 ساخته شد. این محلول تقسیم بندی شد و تا زمان استفاده در فریزر۲۰- نگهداری شد.

- روش کار به صورت میکروبرادفورد

از محلول استاندارد پروتئین با غلظت mg/ml 1000 توسط آب مقطر رقت های متوالی^[۶۳] در غلظتهای مختلف mg/ml 1000، ۵۰۰، ۲۵۰،و ۱۲۵ تهیه گردید. سپس ۱۰ میکرولیتر از رقت های تهیه شده را با ۲۰۰ میکرولیتر معرف برادفورد در پلیت ELISA مخلوط گردید و به آرامی شیک شد. بعد از گذشت ۵-۱۵ دقیقه جذب آنها را در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد.
برای نمونه های مجهول (میکروزوم و سیتوزول بافت کبد) به ترتیب رقت های ۱ به ۱۰ و ۱ به ۳۰۰ و (میکروزوم و سیتوزول بافت کولون) رقت های ۱ به ۱ و ۱ به ۳۰ تهیه گردید. سپس به ۱۰ میکرولیتر از نمونه رقیق شده، ۲۰۰ میکرولیتر از معرف برادفورد اضافه گردید و بعد از گذشت ۱۰-۱۵دقیقه جذب آنها را در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد غلظت پروتئین نمونه ها از روی منحنی استاندارد محاسبه گردید و سپس ضریب رقت در آنها اعمال شد.

جدول ۲-۲. میزان جذب برای غلظت های مختلف استاندارد BSA

۲-۳-۴- اندازه گیری فعالیت ویژه آنزیم گلوتاتیون - S- ترانسفراز سیتوزولی (GST) ^[۶۴] در سیتوزول بافت کبد (۴)

مفاهیم زیر براساس نظر انجمن بین المللی بیوشیمی (IUB)^[65] برای فعالیت آنزیم تعریف شده‌اند:
الف) واحد بین المللی آنزیم (IU) ^[۶۶]: مقدار آنزیمی که تشکیل یک میکرومول محصول در دقیقه را تحت شرایط معین کاتالیز می کند.

ب) غلظت آنزیم: در یک نمونه ناخالص، غلظت آنزیم بر حسب واحد بین المللی (I.U) به حجم نمونه محاسبه می گردد. (units/ml)
ج) فعالیت ویژه آنزیم (S.A) ^[۶۷]: فعالیت ویژه آنزیم بر حسب واحد بین المللی آنزیم (فعالیت آنزیم) به مقدار پروتئین نمونه محاسبه می گردد.

برای اندازه گیری فعالیت، GST از سوبسترا های متفاوتی استفاده می شود که هر کدام نیاز به شرایط ویژه ای دارند. غلظت سوبسترای انتخابی مساوی و یا کمتر از Km آن انتخاب می شود و تغییرات جذب در حداقل زمان ممکن اندازه گیری می شود. زمان مناسب برای سنجش فعالیت آنزیم GST سه دقیقه می باشد.