mg 2-1

Bromophenol blue

۳-۲-۴-۸- تهیه محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو
کوماسی بلو رنگی است که با برهمکنش های واندروالس و الکترواستاتیک به گروه NH₃ ⁺ پروتئین ها متصل می شود. برای تهیه این محلول ۱/۰ گرم پودر کوماسی بلو R-250 در۳۰ میلی لیتر استیک اسید و ۶۰ میلی لیتر آب مقطر حل می شود. باند های پروتئینی بر روی ژل با رنگ آمیزی به وسیله این محلول به رنگ آبی نمایان می شوند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۲-۴-۹- تهیه محلول رنگ زدای کوماسی بلو
از این محلول برای رنگ زدایی کوماسی بلو از ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود. برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر از این محلول، ۱۰ میلی لیتر استیک اسید خالص و ۳۰ میلی لیتر اتانول با ۶۰ میلی لیتر آب مقطر مخلوط می شوند.
۳-۳- روش های استفاده شده در این پژوهش
۳-۳-۱- تخلیص آلفا کریستالین
برای خالص سازی پروتئین آلفا کریستالین از لنز گاو به روش کومار و همکاران عمل شد. به طور خلاصه، تعدادی لنز چشم تازه گاو تهیه شد. پس از جداسازی کپسول پوشاننده ی سطح این لنزها بخش کورتکس جدا شده در بافر تریس ۸pH ، حاوی ۱۰۰ میلی مولار نمک سدیم کلرید، ۵/۰ میلی مولار ^[۸۳]EDTA، %۰۱/۰ سدیم آزید و ۱۰ میلی مولار بتا مرکاپتو اتانول تحت سرما هموژنیزه گردید. سانتریفیوژ نمونه های هموژنیزه شده در در دمای ۴ درجه سانتی گراد و با دور g10000 انجام شد. سپس قسمت محلول نمونه ها که حاوی کل پروتئین های لنز چشم می باشد از بخش ته نشین شده جدا گردید. به منظور خالص سازی آلفا کریستالین لنز چشم، این محلول (حجم یک میلی لیتر) به ستون کروماتوگرافی فیتراسیون ژلی حاوی ماتریکس سفاکریل S-300 که قبلا با بافر (تریس ۸ pH) به تعادل رسیده بود منتقل شد. محلول خروجی با سرعت جریان ۲۵/۰ میلی لیتر بر دقیقه در لوله های آزمایش جمع آوری شد. در ادامه تعیین غلظت نمونه های خارج شده از ستون کروماتوگرافی با روش برادفورد صورت گرفت. پس از تعیین غلظت، نمونه های پروتئینی به ژل آکریل آمید (۱۲درصد) منتقل شد. نمونه های حاوی آلفا کریستالین نیمه خالص تغلیظ و مجددا به ستون سفاکریل S-300 منتقل شد و تحت همان شرایط قبلی خالص سازی انجام گرفت تا پروتئین های آلفا کریستالین با درصد خلوص بالا به دست بیاید. نهایتا محلول های حاوی آلفا کریستالین خالص شده با ژل آکریل آمید (۱۲درصد)، ابتدا بر علیه آب مقطر و سپس بر علیه بافر فسفات دیالیز شد و در ادامه برای مطالعه فعالیت چاپرونی استفاده شد.
۳-۴- روش های تحقیق
۳-۴-۱- فرایند استیلاسیون هورمون انسولین پانکراس گاوی با آسپیرین
استیلاسیون هورمون انسولین ضمن انکوباسیون با آسپیرین به مدت ۲۰ و ۳۶ روز انجام گرفت. نمونه انسولین با غلظت ۲ میلی گرم در میلی لیتر در حضور غلظت ۱۵ میلی مولار آسپیرین و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در شرایط استریل انکوبه شد. انسولین و آسپیرین هر دو در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH حل شدند. تمامی مراحل انکوباسیون در زیر هود لومینار که از قبل با الکل و پرتو فرابنفش استریل شده بود، صورت گرفت. نمونه های پروتئین و آسپیرین با فیلتر سرنگی ۲/۰ میکرومتر فیلتر شد. همچنین پروتئین انسولین بدون حضور آسپیرین در شرایط یکسان جهت استفاده به عنوان نمونه کنترل انکوبه شد. پس از سپری شدن زمان انکوباسیون به منظور حذف مولکول های آسپیرین واکنش نداده با پروتئین، نمونه های پروتئینی استیله شده علیه بافر فسفات به مدت ۲۴ ساعت به وسیله ی کیسه دیالیز دارای cut-off برابر ۳ کیلو دالتون دیالیز شد.
۳-۴-۲- الکتروفورز ژلی هورمون انسولین استیله و غیر استیله به منظور بررسی میزان استیلاسیون و تشکیل توده های پروتئینی با وزن مولکولی بالا
در این پژوهش نمونه های انسولین در حضور و عدم حضور آسپیرین با غلظت ۱۵ میلی مولار در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH به مدت ۲۰ و ۳۶ روز در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. بعد از اتمام زمان انکوباسیون ۲۰ میکروگرم از هر نمونه پروتئینی به درون چاهک های ژل طبیعی و SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیر احیایی (ژل ۱۸ درصد) برای بررسی حدواسط های با وزن مولکولی بالا منتقل شد. لازم به ذکر است که بافر انتقال ژل طبیعی فاقد SDS می باشد. باندهای پروتئینی بعد از رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو R₂₅₀ و محلول رنگ بر حاوی ۱۵ در صد متانول و ۱۰ در صد اسید استیک شناسایی شد.
۳-۴-۳- تعیین گروه های آمین آزاد/ غیر واکنش دهنده در هورمون انسولین
برای نشان دادن میزان استیلاسیون هورمون انسولین با آسپیرین، از دو روش OPA و فلورسامین استفاده شد. این روش های سنجش بر اساس واکنش بین دو ترکیب با گروه های آمین آزاد غیر واکنش دهنده (α و ε ) انجام می گیرد. روش کار با OPA به این صورت است که ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه های پروتئینی (استیله و غیر استیله) با غلظت ۲ میلی گرم در میلی لیتر به ۱ میلی لیتر محلول تازه تهیه شده آن اضافه شد. بعد از گذشت۲ دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق میزان جذب نمونه ها به وسیله ی دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۳۴۰ نانومتر اندازه گیری شد. از محلول OPA برای صفر کردن دستگاه استفاده شد. تمامی آزمایش ها به صورت سه بار تکرار انجام شد. گروه های آمین آزاد نمونه های انسولین استیله و غیر استیله با روش سنجش فلورسامین نیز بررسی گردید. در این روش بر اساس نشر فلورسانس ترکیب فلورسامین می توان میزان استیله شدن پروتئین انسولین به وسیله آسپیرین را بررسی کرد. در این مطالعه مقدار ۲۵ میکرومتر از هر نمونه پروتئینی با غلظت ۱ میلی گرم در میلی لیتر با ۵۰۰ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار و ۲۲۵ میکرولیتر آب مقطر مخلوط شد. در نهایت مقدار ۲۵۰ میکرولیتر از محلول فلورسامین به آن اضافه شد. محلول فوق به مدت ۱۰ دقیقه در تاریکی انکوبه شده و سپس نشر آن به وسیله دستگاه فلورسانس مطالعه شد. طول موج برانگیختگی در۳۹۰ نانومتر تنظیم شد و طیف نشری
نمونه ها در محدوده طول موج های ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر جمع آوری گردید که البته طول موج ۴۹۰ نانومتر به عنوان بیشینه ی نشر مدنظر بود. همچنین شکاف های برانگیختگی و نشری فلورسانس در این مطالعه به ترتیب ۵ و ۱۰ نانومتر انتخاب شد.
۳-۴-۴- مطالعه فلورسانس ذاتی هورمون انسولین در حضور آسپیرین
در این پژوهش هم فلورسانس ذاتی^[۸۴] و هم فلورسانس محیطی^[۸۵] (عارضی) برای مطالعه ی تغییرات ساختاری پروتئین انسولین استفاده شد. برای بررسی تغییرات ساختار سوم پروتئین ها متاثر از عوامل محیطی، به نظر می رسد روش نورسنجی فلورسانس روش مناسب و کارآمدی باشد. در روش مطالعه فلورسانس، مولکول ها اغلب به حالت تهییج رفته و سپس ضمن برگشت به حالت پایه بخشی از انرژی را به صورت نشر فلورسانس از دست می دهد. طیف نشری همواره دارای انرژی کمتر و دامنه طول موج بزرگتر در قیاس با طول موج محرک اولیه است، زیرا ضمن برگشت مولکول از حالت تهییج^[۸۶] به یکی از سطوح ارتعاشی حالت پایه، بخشی از انرژی به صورت گرما و بخش دیگر به صورت نشر فلورسانس رها می شود. شدت فلورسانس اغلب با واژه بازده کوانتومی بیان می شود. بازده کوانتومی را با نماد تک حرفی و اختصاری Q و به صورت زیر نشان می­ دهند.
معادله ی ۳-۲ تعداد فوتون جذبی/ تعداد فوتون نشری Q =
دو عامل داخلی و خارجی اغلب شدت فلورسانس (Q) را متاثر می کنند. خاصیت نشر فلورسانس مولکول ها اغلب در محیط آبی فروکش می شود. بر عکس در محیط های غیر قطبی یا محیطی با شرایط اتصال محکم این پدیده تشدید می گردد. هم فرایند فروکش^[۸۷] و هم تشدید فلورسانس اطلاعات با ارزشی را در خصوص ساختار و عملکرد پروتئین در اختیار می گذارند. برخی مولکول ها دارای فلورسانس ذاتی هستند. در پروتئین ها شاخه جانبی اسیدهای آمینه ی آروماتیک فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان و همچنین کوآنزیم های نظیر NAD و FAD و در اسیدهای نوکلئیک حلقه های پورپنی و پیریمیدینی دارای خاصیت فلورسانس ذاتی می باشند (Liu و همکاران ۲۰۰۰). در پروتئین ها فلورسانس ذاتی اغلب به منظور مطالعه تغییرات ساختار فضایی و همینطور موقعیت جایگاه های فعال و همچنین موقعیت کوآنزیم ها استفاده می شود.
در این مطالعه همه اندازه گیری های فلورسانس در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷pH ، در دمای۳۷ درجه سانتی گراد و به کمک دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclips ساخت کشور استرالیا) انجام شد. این دستگاه دارای لامپ زنون و گزارش گر داده ای DR3 بود. هم نمونه های انسولین غیر استیله (کنترل) و استیله رقیق شدند و غلظت آن ها قبل از اندازه گیری فلورسانس ذاتی به ۴/۰ میلی گرم بر میلی لیتر رسید. انسولین فاقد اسید آمینه آروماتیک است و از این رو وقتی این پروتئین در طول موج ۲۹۵ نانومتر برانگیخته شود، فاقد نشر در محدوده ی طول موج ۳۰۰ تا ۵۰۰ نانومتر می باشد. برانگیختگی انسولین در طول موج ۲۷۶ نانومتر (به علت داشتن ۴ تیروزین) دارای نشر قابل توجه در محدوده ی طول موج بین۲۸۰ تا ۳۸۰ نانومتر می باشد و از این خاصیت برای بررسی فلورسانس ذاتی این پروتئین استفاده شد (Menendez و همکاران ۱۹۶۹). در این پژوهش شکاف برانگیختگی و نشری فلورسانس به ترتیب ۵ و۱۰ نانومتر بود.
مطالعات فلورسانس ذاتی برای بررسی تغییرات ساختاری پروتئین کاربرد دارد و کاهش شدت فلورسانس، نشان دهنده حرکت اسید آمینه آروماتیک به سطح قطبی است. درنتیجه اگر در شرایط خاص (دما، اتصال لیگاند یا تغییرات pH) شدت فلورسانس کاهش یابد، نشان دهنده این است که اعمال این شرایط باعث باز شدن پروتئین می شود. در صورتیکه افزایش شدت فلورسانس، نشان دهنده حرکت اسید آمینه آروماتیک به بخش غیرقطبی و داخلی پروتئین است.
۳-۴-۵- مطالعه فلورسانس عارضی هورمون انسولین در حضور آسپیرین
برای بررسی مولکول هایی که واجد گروه فلور ذاتی نیستند از ترکیبات خارجی موسوم به فلور عارضی استفاده می شود. در این حالت نشر فلورسانس را فلورسانس عارضی می نامند. فلور عارضی مولکولی است که به سیستم بیوشیمیایی به منظور ایجاد نشر فلورسانس اضافه می شود. بنابراین افزودن یک ماده فلورسانس به ماکرومولکول برای مطالعه ی آرایش فضایی را مطالعه فلورسانس محیطی یا عارضی آن نیز می گویند.
مطالعه ی فلورسانس عارضی انسولین در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷pH و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و به وسیله ی دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclipsساخت کشور استرالیا) انجام شد. در مطالعه فلورسانس عارضی از ترکیب فلور ANS استفاده شد. غلظت نهایی انسولین و ANS، در نمونه های انسولین استیله و غیر استیله به ترتیب ۴/۰ میلی گرم بر میلی لیتر و ۵۰ میکرومولار بود. نمونه های فوق پس از ۳۰ دقیقه انکوبه در تاریکی و در دمای اتاق به کُوِت فلورسانس منتقل شدند. آنگاه هر نمونه در طول موج ۳۶۵ نانومتر برانگیخته شد و طیف های نشری در محدوده طول موج ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر جمع آوری شد.
شکل ۳-۷- دستگاه فلورسانس Cary-Eclips.
۳-۴-۶- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی هورمون انسولین در حضور آسپیرین با بهره گرفتن از آزمون فلورسانس تیوفلاوین T (ThT) و آزمون اسپکتروسکوپی سنجش جذب کنگورد
به منظور مطالعه تشکیل فیبر آمیلوئید از رنگ تیوفلاوین T استفاده شد. در صورت تشکیل فیبر این ساختار در طول موج ۴۸۵ نانومتر دارای بیشینه نشر (Fmax) خواهد بود. این پژوهش به کمک دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclips) و در دمای ثابت ۳۷ درجه سانتی گراد انجام شد. بافر استفاده شده در این پژوهش بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH بود. در این مطالعه غلظت نهایی تیوفلاوین T و نمونه های پروتئینی به ترتیب ۲۰ میکرومولار و ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر بود. هر نمونه در طول موج ۴۴۰ نانومتر برانگیخته شد و طیف نشری آن در محدوده بین طول موج ۴۵۰ تا ۶۰۰ نانومتر جهت مطالعه تاثیر استیلاسیون بر فیبریلاسیون هورمون انسولین گزارش شد.
روش دیگر برای بررسی وجود فیبر آمیلوئید در محیط استفاده از رنگ کنگورد می باشد. طیف جذبی کنگورد به تنهایی در ۴۹۸ نانومتر دارای بیشینه است که با اتصال کنگورد به فیبر آمیلوئیدی دارای جآبجایی به سمت طول موج های و افزایش جذب است. در این پژوهش غلظت ۱۰ میکرومولار محلول کنگورد به نمونه های پروتئینی با غلظت ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر اضافه گردید و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق در شرایط تاریکی انکوبه شد. پس از ۱۵ دقیقه طیف جذبی هر نمونه بین طول موج۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد.
۳-۴-۷- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین استیله و غیر استیله
مطالعه سنیتیک توده ای شدن نمونه های انسولین استیله و غیراستیله با افزودن ۲۰ میلی مولار DTT در دمای ۴۰ درجه سانتی گراد و به مدت ۱۵ دقیقه در طول موج ۳۶۰ نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر انجام گرفت. تمامی آزمایش ها در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH انجام شد.
۳-۴-۸- مطالعه اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی در القاء تشکیل فیبر آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله
انسولین در حضور و عدم حضور آسپیرین ۱۵ میلی مولار به مدت ۲۰ روز در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. در این پژوهش از مواد شیمیایی نظیر اوره، TFE و EDTA به عنوان استرس شیمیایی استفاده شد. نمونه های پروتئینی با غلظت ۲ میلی گرم در میلی لیتر در حضور اوره ۳ مولار و TFE 10 درصد در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد طی ۱۵ ساعت انکوبه گردید.
در مطالعه دیگر نمونه های انسولین استیله و غیراستیله (۲ میلی گرم در میلی لیتر) در حضور غلظت ۲ میلی مولار ترکیب EDTA به مدت ۱۲۰ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شدند.
به منظور بررسی استرس فیزیکی، نمونه های پروتئینی با غلظت ۲ میلی گرم در میلی لیتر در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار به مدت ۲ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
برای مطالعه تشکیل فیبر آمیلوئید از رنگ تیوفلاوین T استفاده شد. این پژوهش به کمک دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclipsساخت کشور استرالیا) و در دمای ثابت ۳۷ درجه سانتی گراد انجام شد. در این آزمایش غلظت رنگ تیوفلاوین T و انسولین به ترتیب ۲۰ میکرومولار و ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر بود. پس از انتقال نمونه ها به کوت فلورسانس، هر نمونه در طول موج ۴۴۰ نانومتر برانگیخته و طیف های نشری در محدوده بین طول موج ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر گزارش شد.
۳-۴-۹- مطالعه جلوگیری از توده ای شدن هورمون انسولین استیله و غیر استیله با چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین
انسولین پانکراس گاوی (۲ میلی گرم در میلی لیتر) در حضور و غیاب آسپیرین در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH به مدت ۲۰ روز در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. توده ای شدن نمونه های پروتئینی با غلظت ۲۰ میلی مولار DTT القاء شد. اندازه گیری میزان جذب نمونه های ذکر شده در طول موج ۳۶۰ نانومتر انجام پذیرفت. به منظور جلوگیری از فرایند توده ای شدن از پروتئین های چاپرونی بتا کازئین و آلفا کریستالین با غلظت های ۰۵/۰ ، ۱/۰ و ۲/۰ میلی گرم درمیلی لیتر استفاده شد.
۳-۴-۱۰- مطالعه ساختار دوم انسولین به روش دو رنگ نمای دورانی در حضور آسپیرین
دو رنگ نمای دورانی^[۸۸] (CD) روشی مبتنی بر طیف سنجی است که بر اساس تفاوت در میزان جذب نور قطبیده راست دوران کننده و نور قطبیده چپ دوران کننده به وسیله ملکول فعال از لحاظ نوری استوار است. از این روش برای بررسی ساختار پلیمرهای زیستی مانند پروتئین و اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.
به منظور بررسی اثر استیلاسیون روی ساختار دوم انسولین از محدوده ی دور فرابنفش (Far-UV CD) یعنی طول موج ۱۹۰ تا ۲۶۰ نانومتر به کمک دستگاه CD (مدل۲۱۵ Aviv، ساخت کشور آمریکا) مجهز به سیستم دمایی استفاده گردید. قبل از اندازه گیری CD، همه نمونه های پروتئینی مربوطه رقیق شدند به طوری که غلظت آن ها به ۲/۰ میلی گرم در میلی لیتر رسید. سپس هر یک از این نمونه ها به داخل کُوِت مناسب مطالعات CD منتقل شد. تمام اندازه گیری ها در دمای ۲۷ درجه سانتی گراد انجام شد.
با در نظر گرفتن ۵۱ اسید آمینه و وزن مولکولی ۵۷۰۰ دالتون برای انسولین پانکراس گاوی نتایج به صورت بیضیت مولاری^[۸۹] بر اساس معادله ی ۳-۳ گزارش شد (Bandyopadhyay و همکاران ۲۰۰۰).
معادله ی ۳-۳ [θ]_λ= (۱۰۰ . (MRW) . [θ]_obs /Cl)
در معادله فوقθ_obs ، بیضیت مشاهده شده در طول موج معین،C غلظت پروتئین بر حسب میلی گرم در میلی لیتر و L طول مسیر نور بر حسب سانتی متر است. MRW، میانگین وزن باقی مانده های اسید آمینه ای است که به طریق M/(N-1) محاسبه می شود. M و N به ترتیب وزن مولکولی زنجیره پلی پپتیدی و تعداد اسیدآمینه ها در زنجیره ی پلی پپتیدی می باشد. در آخر بیضیت های مشاهده شده از بیضیت بافر کم شد و نتایج بدست آمده به وسیله نرم افزار ^[۹۰]CDNN آنالیز شد. آنگاه میزان ساختارهای دوم بر اساس درصد محاسبه شد.
شکل ۳-۸- نمایی از دستگاه دورنگ نمای دورانی۲۱۵ Aviv.
۳-۴-۱۱- مطالعه هورمون انسولین به روش دستگاه پراکندگی پویای نور در حضورآسپیرین