• آب مقطر

• سرنگ با سرسوزن گیج ۲۱

• رک لوله فالکون و فالکون­های ۱۵ و ۵۰ میلی لیتری استریل(شرکت Falcon آمریکا)

• پیپتگیر اتوماتیک (شرکت Eppondrof آلمان) پیپت در اندازه­ های ۵، ۱۰ میلی لیتری استریل

• سمپلر ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرولیتری استریل

• تریپان بلو(شرکت Sigma آمریکا)

• لام نئوبار

• لامل سنگی

• پنبه، دستکش استریل

• الکل ۷۰% (شرکت رازی ایران)

روش کار

• پنبه آغشته به اتر داخل ظرف شیشه ­ای انداخته و تا بیهوشی رت، داخل آن نگه داشته شد.

• حیوان بیهوش شده به الکل ۷۰% آغشته شد، در وسط ناحیه شکمی و پایین تر از استخوان جناغ سینه برشی ایجاد و خون به طور مستقیم از قلب حیوان اخذ شد.

• با آماده سازی هود لامینار، در فالکون ۱۵ میلی لیتری، ml5 خون هپارینه (۱۰µl/ml) رت با حجم مساوی ۱:۱ از سرم فیزیولوژی ۹/۰ % رقیق شد.

• به طور جداگانه، ml1 از مگلومین در ۴ فالکون باml 3 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % ورتکس شد.

• ml 2 خون رقیق شده توسط سمپلر ۱۰۰۰ میکرولیتری به آرامی در هر فالکون اضافه شد.

• فالکون­ها به مدت ۱۵ دقیقه با دورrpm/min 2400 سانتریفیوژ شد.

• مایع رویی رسوب سلولی خارج و رسوب حاصل را باµl 400 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % همگن نموده و محتویات ۴ فالکون در یک فالکون ۵۰ میلی لیتری ریخته و µl500 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % به آن اضافه گردید.

• در این مرحله جهت لیز سلولی گلبول­های قرمز، با بهره گرفتن از پیپت،ml 20 آب مقطر سرد استریل به مدت ۴۰-۳۰ ثانیه به فالکون اضافه و بلافاصلهml 10 سرم فیزیولوژی ۵۵/۲ % داخل فالکون ریخته و مخلوط گردید.

• فالکون به مدت ۵ دقیقه با دورrpm/min 2400 سانتریفیوژ شد (مرحله ۹و ۸ دو مرتبه تکرار شد).

• مایع رویی تخلیه و رسوب باml 1 دکستروز ۵% بخوبی همگن شد.

• زنده­مانی و تعداد سلول با بهره گرفتن از روش تریپان بلو تعیین گردید. در هر جداسازی تعداد/ml 10⁶×۴ جدا می­شد.

۳-۷- تیمار سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت با ویتامینD3(et al;2012 Klotz Artaza et al.,2010,)
با رسیدن سلول ها به ۷۰ درصد برآمدگی در روزهای ۱۰-۷ پس از کشت پاساژ سوم، فلاسک ها را از انکوباتور خارج کرده و به زیر هود لامینار فلو انتقال دادیم(۱۵دقیقه قبل از شروع کار هود روشن و زیر هود الکل پاشی گردیده بود) و تیمار سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت با غلظت های nm50،nm 100،nm 200 از ویتامینD3 انجام گرفت و فلاسک­های حاوی سلول­های بنیادی مزانشیما مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 همراه با سلول­های بنیادی مزانشیمی تیمار نشده، به عنوان گروه کنترل به مدت ۲۴،۴۸و۷۲ ساعت انکوبه گردید.
۳-۸- مجاور­سازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 و مایع رویی آنها با نوتروفیل های جدا شده از خون محیطی موش نژاد ویستار(et al;2012 Klotz Artaza et al.,2010,)
۳-۸-۱- مجاورسازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

• پس از اتمام زمان انکوباسیون، تعداد ۱۰^۶×۵ سلول نوتروفیل جدا شده که از خون محیطی رت­ها به کمک مگلومین کامپاند(داروپخش- تهران)جدا سازی شده بودند به همراه ۵ سی­سی محیط کشت DMEM و۱۰درصد FBS به داخل فلاسک حاوی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده و کنترل اضافه گردید و به مدت ۴ ساعت تحت شرایط ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵ درصد CO₂ و رطوبت ۸۰ درصد انکوبه شدند. لازم به ذکر هست از سلولهای نوتروفیل مجاور نشده به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

• بعد از گذشت مدت زمان انکوباسیون مایع رویی داخل فلاسک، داخل لوله فالکنml15 استریل جمع آوری و به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. پلت سلولی جهت انجام تست­های تکمیلی به صورت سوسپانسیون درآمد.

۳-۸-۲- مجاور سازی مایع­رویی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

• پس از اتمام زمان انکوباسیون، مایع­رویی سطح سلول­های بنیادی مزانشیمی موجود در فلاسکT25 در یک لوله فالکن ml15 استریل جمع­آوری گردید.

• مایع­رویی حاصله را به یک پلیت ۲۴ خانه ته تخت انتقال داده به طوری که کف خانه­ها با مایع­رویی پوشانده شد. سپس تعداد۱۰^۶×۵ سلول نوتروفیل به همراه۱۰ درصدFBS به داخل هر خانه حاوی مایع­رویی اضافه شد و سپس به مدت ۴ ساعت تحت شرایط ۳۷درجه سانتی گراد با ۵درصد CO₂ و رطوبت ۸۰ درصد انکوبه شدند.

• • • بعد از گذشت مدت زمان انکوباسیون نوتروفیل­ها برای انجام تست­های تکمیلی جداسازی شدند.

  (( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۹- فاگوسیتوز مخمر (Delirezh et al., 2010)
مراحل انجام این تست به دلیل تفاوت سلول مورد استفاده (نوتروفیل بجای مونوسیت و مخمر تازه کشت شده بجای پودر مخمر) با مقداری تغییر نسبت به رفرنس اشاره شده انجام گرفت.
۳-۹-۱- آماده سازی سوسپانسیون مخمر
مواد و وسایل مورد نیاز

• هود

• انکوباتور معمولی

• سانتریفیوژ

• کشت تازه ۲۴ساعته سویه استاندارد(PTCC5027) مخمر کاندیدا آلبیکنس^[۵۵] (تهیه شده از بخش قارچ شناسی گروه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی ارومیه)

• محیط کشت RPMI 1640 (Gibco, UK)

• فسفات بافر سالین PBS (شرکت Sigma آمریکا)

• سرم تازه خون رت

• رک لوله فالکون و فالکون ۱۵ میلی لیتری استریل(شرکت Falcon آمریکا)