در سال ۲۰۰۹ انتقال عوامل نسخه برداری GhDREB1 پنبه به گندم با بهره گرفتن از روش تفنگ ژنی تحت پروموتور ubiqutin منجر به افزایش مقاومت به تنش های خشکی، شوری و سرما گردید (Gao et al., 2009).
۲-۱۰ ژن WDREB2 (TaDREB2)
عامل رونویسی WDREB2^[96] ارتولوگ ژن DREB2A آرابیدوپسیس بوده و با آن همولوژی بالایی دارد. این ژن با عامل رونویسی HvDRF1 نیز همولوژی بالا دارد. عامل رونویسی WDREB2 یا TaDREB1 در گندم، یک پروتیین باند شونده به توالی CRT/DRE را کد می کند و در پاسخ به تنش های غیر زیستی نقش بسیار مهمی ایفا می کند. این عامل رونویسی ژن های پایین دست COR/LEA را فعال می کند و بیان آن تحت تاثیر تنش خشکی ، سرما ، اسید آبسیزیک و شوری القا می شود .(Egawa et al., 2006)
بیان ژن WDREB2 در سطح پس از رونویسی به وسیله مکانیزم Alternate Splicing تنظیم می شود. ژن WDREB2 دارای ۳ ایزوفرم مختلف α، β و γ می باشد که نتیجه فرایند alternate splicing، پس از رونویسی^[۹۷] در این ژن است. این ژن دارای ۴ اگزون و۳ اینترون می باشد و هر ۳ رونوشت دارای اگزون ۴ است. وجود اگزون ۲ در فرم بتا منجر به تغییر در چارچوب خواندن^[۹۸] و ایجاد کدون ختم شده و رشته پلی پپتید غیر فعال بدون دومین ERF/AP2 را کد می کند (Egawa et al., 2006).
تحت تنش های خشکی و شوری میزان فرم بتا ، تا ۲۴ ساعت ثابت باقی می ماند در حالی که فرم های آلفا و گاما افزایش موقتی نشان می دهد (Egawa et al., 2006). مکانیزم Alternate splicing در اجداد دیپلویید گندم منجر به ایجاد فرم های فعال و کاهش تدریجی فرم های غیرفعال در شرایط تنش شده ولی در ارقام هگزاپلویید فرم غیر فعال در شرایط تنش همچنان وجود دارد. بررسی بیان ژن نشان می دهد که دو مسیر برای فعال سازی و splicing ژن در شرایط تنش خشکی ، شوری و سرما وجود دارد. اینکه چرا فرم غیر فعال در مقایسه با فرم های فعال در شرایط تنش در سطح بالایی قرار دارد مشخص نشده است (Terashima and Takumi, 2009).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

آنالیزهای زیست سنجی گیاهان توتون تراژن نشان می دهد که بیان فرم گامای عامل رونویسی WDREB2 تحت کنترل پروموتر عمومی ۳۵S CaMV در توتون منجر به افزایش مقاومت به تنش های اسمزی، شوری و سرما شده است (Kobayashi et al., 2008). جداسازی آلفا TaDREB2 و بیان آن در گیاه گوجه فرنگی که در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه شیراز انجام شد، منجر به افزایش مقاومت به تنش سرما گردید (سازگاری و نیازی.، ۱۳۸۹).
فصل سوم
۳- مواد و روش ها
۳-۱ آماده کردن ژن WDREB2
ایزوفرم فعال ژنWDREB2 که در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه شیراز در قالب موضوع پایان نامه توسط خانم سازگاری و دکتر نیازی جدا سازی در پایگاه اطلاعات زیست فناوری NCBI به شماره HQ171443 ثبت شد، برای استفاده در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. این ژن توسط همین محققین در حامل بیان pBI121 همسانه سازی شد.
۳-۲ انتقال پلاسمید به باکتری آگروباکتریوم
۳-۲-۱ استخراج پلاسمید های PBI121 دارای ژن WDREB2
استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری جهت انتقال به باکتری آگروباکتریوم طبق دستورالعمل روش جوشاندن (Holmes and Quigley, 1981) به صورت زیر انجام شد.
ml2 از محیط کشت LB مایع حاوی سلول باکتری، بعد از سپری شدن یک شب در دمای C° ۳۷ در ویال ریخته شد و به مدت ۱ دقیقه در۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد.
رسوب حاصل بعد از حذف رونشین در ۳۵۰ میکرولیتر بافر) STET 8 mM PH 50 , Tris- HCl 5 , Sucrose %8 100 mM , Triton X – ۵۰ ( EDTA حل و ورتکس شد تا به خوبی حل شود.
بعد از اضافه کردن ۵/۱۲ میکرولیتر آنزیم لیزوزیم (mg/ml20در ۸pH= mM, 10( Tris- Hcl ، ویال حاوی محلول سروته شده و به مدت ۱ دقیقه در آب جوش حرارت داده شد.
رسوب حاصله بعد از سانتریفوژ شدن به مدت ۲۵ دقیقه در ۱۲۰۰۰دور در دقیقه، به کمک خلال دندان حذف شد.
۴۰ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار(۲/۵ pH= ) و ۲۲۰ میکرولیتر ایزوپروپانول ۵/۹۹% فریز شده به محلول حاصله اضافه شده و بعد از چند بار سروته کردن در ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شد.
رسوب بعد از حذف رونشین با ۵۰۰ میکرولیتر اتانول ۸۰% شستشو داده شده و با بهره گرفتن از دستگاه تغلیظ کننده^[۹۹] مدل ۵۳۰۱ شرکت اپندورف خشک شد در نهایت، رسوب حاوی DNA پلاسمید در ۳۰ میکرولیتر آب مقطر استریل حاوی آنزیم RNase حل شد و میکروتیوب های دارای پلاسمید به مدت ۳۰ دقیقه در دمای C°۳۷ قرار داده شد.
۳-۲-۲ تراریزش پلاسمیدهای pBI121 نوترکیب به درون سلولهای مستعد آگروباکتریوم
به منظور تراریختی باکتری های آگروباکتریوم، روش استاندارد انجماد و ذوب^[۱۰۰] استفاده شد(Sambrook and Russel., 2001). آماده سازی سلول باکتری و تراریختی به شرح زیر انجام شد.
یک کلونی از باکتری آگروباکتریوم در ۵ میلی لیتر محیط LB حاوی آنتی بیوتیک ریفامپیسین در ۲۸ درجه سانتیگراد به مدت ۱۶ساعت، کشت داده شد.
پس از رشد مناسب ( حدود ۲۴ ساعت )، باکتری ها، در ۴ درجه سانتیگراد با سرعت ۳۵۰۰ دور در دقیقه و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول فوقانی را خارج کرده و رسوب حاصله روی یخ در ۱۰۰ ماکرولیتر از محلول کلرید کلسیم^[۱۰۱]CaCl₂)) (20 میلی مولار) که قبلاً استریل و سرد شده بود، حل شد و محتویات بدست آمده به میکرو تیوب ۵/۱ میلی لیتری منتقل شد.
۴ میکرولیتر از پ
لاسمید (pBI121+WDREB2) را به آن اضافه و به آرامی مخلوط نموده، سپس در ازت مایع قرار داده شد تا مجموعه کاملا یخ بزند.
به مدت ۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد و ۱ میلی لیتر از محیط LB بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه شد.
میکروتیوب را به مدت ۴ ساعت در ۲۸ درجه سانتیگراد با بهره گرفتن از shaker، تکان داده شد.
میکروتیوب حاوی مواد به مدت ۳ دقیقه در دمای محیط با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد.
رونشین حذف شده و رسوب باکتری در۱۰۰ میکرولیتر محیط LB حل شد.
۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری بر روی محیط جامد LB دارای آنتی بیوتیک های اختصاصی ریفامپیسین و کانامایسین کشت داده شد.
پلیت ها در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد و تاریکی به مدت ۲ تا ۳ روز قرار داده شد.
۳-۲-۳ انتخاب کلونی های نوترکیب
بعد از گذشت ۱۶ساعت از کشت باکتری روی محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک های ریفامپسین و کانامایسین، کلون های رشد کرده را در یک فالکون دارای ۵ میلی لیتر محیط کشت LB مایع حاوی ۵۰ میلی گرم در لیتر از آنتی بیوتیک های ریفامپسین و کانامایسین کشت داده شد و به مدت ۱ شب در shaker-incubator قرار داده شد تا رشد کنند.
۳-۲-۴ واکنش زنجیره ای پلیمراز با پرایمرهای اختصاصی برای تایید تک کلون ها
در این مرحله به منظور تائید تک کلون های رشد کرده از واکنش زنجیره ای پلیمراز با بهره گرفتن از آغازگرهای.اختصاصی..TaDREB.(5′-CGGGATCCGACAAGATTGCGAACGCTAGA-3′ TaDREBF و ۵’-CGGAGCTCCCGACCAAACACCATAGACA -3′ TaDREBR) طبق جدول (۳-۱) استفاده شد.
پس از اتمام واکنش، محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی ژل آگارز ۱% رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید الکتروفورز شد تا از وجود قطعه مورد نظر اطمینان حاصل شود.
جدول۳-۱ مواد استفاده شده در هر واکنش PCR و چرخه حرارتی واکنش زنجیره ای پلیمراز TaDREB