۳- روش قطره پلیت
این روش با قرار دادن یک قطره از محلول مورد اندازه‌گیری در روی آگار حاوی میکروب انجام می‌شود. این مقدار از نظر کیفی بیشتر مورد قبول است تا از نظر کمی، چون دارای دقت کافی نیست.
۴- روش دیسک کاغذی[۱۶]
در بیشتر موارد یک دیسک کاغذی را به جای سیلندر و چاهک برای تهیه منبع ذخیره مواد مورد اندازه‌گیری استفاده می‌کنند. محلول‌هایی که بایستی مورد سنجش قرار گیرند را به کمک لوپ یا پی‌پت بر روی دیسک قرار می‌دهند یا این که دیسک‌ها را در محلول مورد نظر انداخته و خیس می‌کنند. دیسک‌ها را ممکن است به حالت تر یا خشک روی پلیت‌ها قرار دهند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
این متد را اولین بار Kirby & Bauer ابداع کردند و آن ها Disc diffusion method نامگذاری کردند. دیسک‌های حاوی ماده مؤثره پس از قرار گرفتن روی سطح پلیت‌ها همراه با اندکی فشار پس از مدت مقرر ایجاد هاله‌های عدم رشد می‌کنند.
به طور کلی این روش از مفیدترین تست‌های آزمایشگاهی است که برای تعیین حساسیت میکروارگانیسم‌ها نسبت به مواد آنتی‌باکتریال به کار می‌رود. با این روش حتی می‌توان محلول‌های حاوی حلال‌های آلی را اندازه‌گیری کرد. دیسک‌ها را با محلول مورد اندازه‌گیری تر کرده و قبل از قرار دادن روی آگار، حلال را تبخیر می‌کنیم. البته از قبل میکروب‌ها را بطور خطی روی آگار کشت داده‌ایم. پس از گذشت زمان مقرر در گرمخانه، قطر هاله‌های عدم رشد نشانگر فعالیت ماده ضد میکروب است.
محاسن روش نسبت به سایر متدها
۱- سادگی: کار خسته کننده پر کردن سیلندرها یا کندن چاهک‌ها را ندارد.
۲- آسانی کار: استریل کردن سیلندرها حذف شده است.
۳- سرعت: کار کردن با دیسک سریع‌تر است و می‌توان تعداد بیشتر نمونه‌ها را در زمان معین سنجش کرد.
۴- آسانی حمل و نقل پلیت‌ها: اشکال جدا شدن سیلندرها از آگار یا ریختن محلول از سیلندر و چاهک را در حین حمل و نقل ندارد.
۵- دقت: در این روش هاله‌های ثابت‌تری ایجاد می‌شود زیرا دیسک‌ها بهتر به سطح آگار چسبیده و انتشار محلول در آگار یکنواخت‌تر است.
۶- امکان اندازه‌گیری موادی که دارای حلال آلی هستند به مراتب بیشتر است. نتایج بدست آمده در روش‌های دیگر، زیادتر و خطاهای بیشتری دیده می‌شود.
۷- مقادیر کمی از محلول برای اشباع شدن یک دیسک لازم است و این حسن به خصوص در مواردی که مقدار نمونه محدود و غلظت آن کم است بسیار کارساز است.
معایب روش
تنها عیب آن حساسیت کمتر نسبت به رقت‌های ضعیف می‌باشد.
فاکتور مؤثر در اندازه‌گیری به روش انتشار
در انجام این متد باید به فاکتورهای زیر توجه کرد تا روی نتایج اثر نگذارند:
الف- آگار
۱- عمق آگار
آگار را ممکن است در پلیت‌های خیلی نازک تقسیم نمایند. لایه‌های نازک ایجاد هاله بزرگ‌تری می‌کند. اکثراً محققین لایه‌های بین ۵-۴ میلی‌متر را مناسب نمی‌دانند.
۲- خشکی آگار
اگر ژل آگار به حد کافی خشک نباشد باعث ایجاد هاله‌هایی با کناره‌هایی نامشخص می‌شود. برخی از محققین عقیده دارند که خشک کردن، از کارهای اساسی است. در صورتی که برخی دیگر از خشک کردن خودداری و صرف نظر می‌کنند. نتیجه این دو بررسی نشان داد که روی هم رفته اگر آگار کمی خشک باشد، هاله‌ها بهتر ظاهر خواهد شد. در موقع خشک کردن باید توجه داشت که از ورود آلودگی هوا جلوگیری شود و با برگرداندن پلیت‌ها روی در آن ها می‌توان این مشکل را حل نمود. خشک کردن را می‌توان در حرارت محیط یا با قرار دادن در گرمخانه‌ای که حرارت آن را زیادتر کرده باشند انجام داد. مدت زمان لازم جهت خشک کردنن بستگی به رطوبت آگار دارد ولی به هر صورت بسته به تجربه مشخص است.
۳- مقدار آگار
عده‌ای معتقدند حساسیت روش انتشار با کم کردن مقدار اگار در محیط کشت زیادتر می‌شود. در هر صورت مقدار آگار به کار رفته در اندازه‌گیری مؤثر است.
۴- pH آگار
منظور اصلی این است که در حدودی مناسب بهترین pH اپتیمم برای رشد میکروارگانیسم انتخاب شود زیرا قطر هاله‌ها با تغییر pH آگار تغییر می‌یابد.
ب- شرایط کشت در گرمخانه
این شرایط شامل زمان و حرارت مناسب جهت انکوباسیون است. نسبت به میکروب و مواد مورد سنجش متفاوت است. میزان انتشار مواد به وسیله اندازه هاله‌های ایجاد شده مشخص می‌شود که بستگی به میزان تکثیر میکروب آزمایشی دارد و فعالیت ماده فقط به وسیله میزان انتشار مواد قبل از شروع تکثیر ارگانیسم اندازه‌گیری می‌شود.
ج- طرز قرار گرفتن ارگانیسم‌ها روی آگار
د- مواد مورد آزمایش (ماده آنتی باکتریال)
۱- خصوصیات ماده‌ای که برای تعیین مقدار، آزمایش می‌شود بایستی به شرح زیر باشد:
- دارای اثر محرکه یا جلوگیری کننده نسبت به میکروارگانیسم‌ها باشد.
- در حلالی قابل انحلال باشد که در غلظت مصرف شده یا اندازه‌گیری تداخل نداشته باشد.
- قابل انتشار در آگار باشد.
۲- مقدار لازم برای تعیین مقدار: انتخاب مقدار لازم از ماده اندازه‌گیری شونده بستگی به فعالیت آن ماده نسبت به میکروارگانیسم مورد نظر دارد.
هـ- حساسیت ارگانیسم مصرف شده
۳-۱-۷-۳- عوامل مؤثر بر نتیجه آزمایش آنتی‌بیوگرام
۱- غلظت تعلیق میکروبی
۲- عمق محیط کشت در پلیت
۳- درجه حرارت گرمخانه
۴- سرعت رشد باکتری
۵- ماهیت باکتری مورد آزمایش
۶- زمان انکوباسیون
۷- استفاده از دیسک‌های تاریخ گذشته
بررسی هاله‌های رشد یا عدم رشد
الف- نوع هاله‌های بدست آمده
هاله‌های مختلفی در نتیجه رشد یا عدم رشد میکروب‌ها روی محیط کشت ممکن است ایجاد شود که در محاسبه و به دست آمدن نتایج دقیق مؤثر باشد. ممکن است هاله‌ها به طور مناسب و با کناره‌های کامل تولید شود و یا این که نامشخص و پخش شده و با کناره‌های چند هاله‌ای یا غیر مدور باشند که به شرایط کار، نوع میکروب، غلظت و سن میکروب مورد آزمایش و نیز ماده مورد نظر اندازه‌گیری بستگی دارد.
گاهی هاله‌های مشخص با کناره کامل تولید می‌شود که این بهترین حالت است و گاهی هاله‌های نامشخص با کناره‌های دندانه‌دار ایجاد می‌شود که در این حالت دقت آزمایشگر در تعیین قطر هاله‌ها بسیار اهمیت دارد. شکل فوق به چندین عامل از جمله پخش میکروارگانیسم در سطح پلیت، نوع میکروارگانیسم و غلظت و سن آن و نیز ماده ضد میکروب وابسته است.
ب- اندازه‌گیری قطر هاله‌ها
قطر هاله‌های عدم رشد و یا رشد را بطور ساده می‌توان اندازه‌گیری کرد. ممکن است خط‌کش یا کاپیلر یا وسایل مخصوص دیگر به کار رود. برای دقت بیشتر Zone reader استفاده می‌شود که خطار آزمایشگر به حداقل برسد.
۳-۱-۱۲ آزمایش آنتی بیوگرام به روش دیسک آگار Disc Diffusion
به این ترتیب که در روش Disc Diffusion که روشی ساده و کم هزینه می‌باشد و توسط آزمایشگاه‌های تشخیصی استفاده می‌شود، دیسک کاغذی که حاوی آنتی بیوتیک مشخص می‌باشد و یک دیسک بلانک آغشته با عصاره چای سبز را بر روی محیط کشت مناسب که قبلاً توسط تعلیق میکروبی آغشته شد در فواصل مناسب قرار داده شد به این ترتیب که یک دیسک در مرکز پلیت و بقیه دیسک‌ها را در اطراف آن قرار دادیم و فاصله دیسک‌ها از لبه پلیت ۱۵ میلی متر و فاصله دیسک‌ها از یکدیگر ۳۴-۳۲ میلی متر بود. این عمل مانع از اثر نواحی ممانعت از رشد روی یکدیگر می‌شود. بعد از گذاشتن هر دیسک روی محیط توسط نوک پنس، مقدار کمی روی آن فشار وارد کرده تا در جای خود محکم شود. باید توجه شود دیسک‌هایی که در سطح پلیت گذاشته می‌شود را نباید برداشت یا جابه جا کرد زیرا به محض تماس دیسک با آگار مرحله انتشار شروع می‌شود. محیط کشت مناسب برای این منظور محیط مولر هینتون آگار (MHA) می‌باشد. در محیط، آنتی بیوتیک و عصاره از دیسک کاغذی آزاد شده و در داخل محیط کشت انتشار می‌یابد. از آن جایی که سرعت آزاد شدن آنتی بیوتیک و عصاره از دیسک کاغذی بیشتر از سرعت انتشار در محیط است در نتیجه همیشه یک غلظت لگاریتمی از آنتی بیوتیک در اطراف دیسک وجود دارد و همین مسئله مانع رشد باکتری حساس می‌شود و هاله ای اطراف هر دیسک به نام هاله عدم رشد به وجود می‌آید که این حالت بعد از حدود ۲۴ ساعت از انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در محیط کشت ظاهر می‌شود. سپس اندازه گیری قطر نواحی ممانعت از رشد توسط یک خط کش میلی متری انجام شد و با بهره گرفتن از نور چراغ میزان حساسیت یا مقاومت باکتری به آنتی بیوتیک و عصاره چای سبز ارزیابی گردید و نتایج به طور دقیق گزارش شد.
