۵) لوله فوق به مدت ۱۰دقیقه دردور۴۰۰۰ سانتریفیوژشد، مایع رویی دور ریخته ورسوب خشک گردید.
۶) ۸ میلی لیتر از محلول CaCl₂-MgCl₂ به لوله فوق اضافه گردید وبه مدت ۳۰ دقیقه برروی یخ قرار گرفت (بایستی با عملpipetting به صورت ملایم وآهسته سلول های رسوب داده شده به صورت سوسپانسیون درآیند).
۷) برداشتن حدود ۳۰۰ میکرولیتر از این مایع و ریختن در لوله اپندورف ۵/۱ میلی لیتر استریل . به این ترتیب سلول های مستعد برای ترانسفورماسیون آماده شدند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
بعد ازمراحل فوق برای نگهداری ذخیره سلول های مستعد،پس ازسانتریفیوژ و دور ریختن مایع رویی می توان با اضافه کردن محلول CaCl₂-MgCl₂ حاوی گلیسرول ۲۰ درصد این سلولها را به مدت طولانی در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری کرد.
۳-۱۱-ترانسفورماسیون :
ترانسفورماسیون فرایندی است که DNA خارجی توسط یک سلول پذیرنده، اسفروپلاست یا پروتوپلاست جذب می شود که ممکن است وارد کروموزوم یا پلاسمید،توسط فرایند نوترکیبی هومولوگی شود. این DNA می تواند قطعه ای ازDNA کروموزومی از یک سویه وابسته، یک پلاسمید یا ژن ویروسی باشد. ترانسفورماسیون می تواند تحت شرایط طبیعی دربرخی ازباکتری ها ( مثل سویه های باسیلوس، هموفیلوس، نایسریا واسترپتوکوکوس ) صورت گیرد، اما در بسیاری ازباکتری ها از جمله E. coli و در برخی از میکروارگانیسم های یوکاریوتی می تواند توسط روش های مصنوعی انجام شود. برای یک ترانسفورماسیون مؤثر، قطعه DNA بایستی به صورت دو رشته ای باشد.DNA به سطح سلول های مستعد به طوربرگشت پذیر می چسبد و این اتصال وابسته به غلظت DNA دهنده می باشد. اما دربرخی از موارد تعداد محدود ازمولکول های DNA به طوربرگشت ناپذیربه جایگاه های گیرنده اختصاصی سطح سلول متصل می شوند. دربرخی ازباکتری ها مثل باسیلوس سابتیلیس واسترپتوکوکوس پنومونیه اتصال DNA به صورت غیراختصاصی است، اما دربرخی ازسویه ها مثل هموفیلوس ونایسریا، وابسته به توالی های اختصاصی می باشد [۶۵].
در برخی از باکتری ها که به صورت طبیعی مستعد نمی باشند مثل E. coli، توسط روش های مصنوعی حالت مستعد بودن در این ها ایجاد می شود. دریکی از این روش ها در غلظت های بالایی ازکلریدکلسیم ( درحد میلی مولار ) همراه با شوک حرارتی سلول های مستعد ایجاد می شود. یون کلسیم اتصال DNA را به سطح سلول بهبود می بخشد و نفوذ پذیری پوشش سلولی را افزایش می دهد. میزان کسب حالت مستعد بودن در محلول یون کلسیم وابسته به حضور غلظت زیاد کمپلکس calcium/hydroxybutyrate-ᵦ-poly polyphosphate درغشا سیتوپلاسمی می باشد. به نظرمی رسد این کمپلکس ،کانال های غشا گذر را تشکیل می دهد، که باعث سهولت انتقال DNA می شود وهمچنین کاتیون های دوظرفیتی ممکن است به عنوان یک پیوند بین DNA و فسفات در دهانه برخی ازکانال ها عمل نمایند [۶۵].
۳-۱۱-۱روش انجام ترانسفورماسیون:
برای ترانسفورماسیون باکتری E. coli ATCC 25922 ابتدا سلول های مستعد تهیه و سپس مراحل انجام ترانسفورماسیون پلاسمید به صورت زیرصورت گرفت :
۱-۵۰ نانوگرم پلاسمید به ۳۰۰ میکرولیترازسلول های مستعد E.coli اضافه شد.(در این حالت استفاده از کنترل مثبت (یک محلول پلاسمیدی وکنترل منفی همانند محصول DNA هضم شده ضروری است).
۲- بلافاصله مخلوط به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ گذاشته شد وسپس به مدت ۹۰ ثانیه در دمای۴۲ درجه سانتیگراد به آن شوک گرمایی داده شد.
۳- مخلوط حاصل ابتدا به ۲میلی لیترمحیط LB منتقل گردید ودردمای ۳۷ درجه سانتیگراد با تکان دادن، به مدت ۱ساعت قرار داده شد.
۴- سپس درمحیط جامد LBA حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین کشت شد ودردمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ساعت گرمخانه گذاری گردید [۶۵].
۳-۱۲- استخراج DNA
۱- یک کلنی از باکتری را در ml5 محیط TSB کشت داده و ۲۴ساعت انکوبه گردید و سپس با ۵/۰ مک فارلند مقایسه شد.
۲- محیط کشت حاوی باکتری در°c95 به مدت ۲۰ دقیقه جوشانده شد .
۳- بعداز خنک شدن محیط کشت در rpm 13000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شد وسپس مایع روئی در میکروتیوب ریخته و هم حجم آن اتانول مطلق که از شب قبل در یخچال بوده، اضافه کرده و به مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار داده شد.
۴- میکروتیوب در rpm 13000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شد مایع روئی دور ریخته شد. (به منظور شستشوی DNA و برای از بین بردن پروتئین احتمالی).
۵- میزان ml5/2 اتانول ۷۰% به رسوب اضافه کرده به مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار داده شد سپس در rpm 13000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شد، محلول روئی را دور ریخته و میزان μl40 بافر TE به رسوب اضافه شد.
۳-۱۳- PCR(واکنش زنجیره ای پلیمرازی):
در این تحقیق به منظور وجود یا عدم وجود ژن مقاوم به آنتی بیوتیک های بتالاکتام در باکتری پروتئوس تست PCR انجام گرفت. برای انجام PCR وجود ژنهای blaTEM و blaCTX-M مورد بررسی قرار گرفتند.
جدول۳-۴پرایمرها
| Seq.(5-3) | Primer Name |
| Atgagtattcaacatttccg | forbla TEM Forward |
| Ccaatgcttaatcagtgagc | forbla TEM Reverse |
| Ggttaaaaaatcactgcgtc | forbla CTx-M Forward |
| Ttggtgacgattttagccgc | forbla CTx-M Reverse |
جدول۳-۵ مواد موردنیاز برای آزمایش PCR
