روش کار
ابتدا Taq DNA Polymerase 2x Master Mix Redو آغازگرها (Primer) از فریزر خارج و مدتی در دمای اتاق قرار داده تا آب شوند. البته کلیه مواد فوق بر روی ظروف حاوی یخ انجام گرفت. مقادیر مورد نیاز از هر ماده، به ترتیب از بیشترین حجم به کمترین حجم در میکروتیوب­های ٢/٠میکرولیتری ریخته شدند. در نهایت بعد از ریختن آب مقطر و پیپتینگ مختصر، میکروتیوب­ها سریعا به دستگاه منتقل شدند تا واکنش تکثیر انجام شود.
در پایان محصولات PCR به یخچال ۴ درجه سانتی ­گراد منتقل شد تا جهت انتقال بر روی ژل آگارز ٢% به منظور مشاهده­ باندهای مورد نظر استفاده شود.
الکتروفورز
برای انتقال محصولات PCR به ژل آنها را به نسبت ۵ به ١ از نمونه و لودینگ بافر مخلوط می­نماییم لودینگ بافر در داخل رشته­ های DNA جایگزین می شود و با نور UV رنگ فلورسنت قابل تشخیص خواهد بود ، حال آن­ها را به چاهک­هایی که در درون ژل تعبیه شده ­اند با دقت انتقال می­دهیم. به چند دلیل از بافر راهنما استفاده می­ شود: ترکیب بافرهای راهنما از ترکیب اصلی رنگ و یک ماده غلیظ و چسبنده مثل گلیسرول یا سوکروز غلیظ تشکیل شده است، ویسکوزیته نمونه با بهره گرفتن از این بافرها افزایش می­یابد و انتقال نمونه به داخل چاهک آسان می­ شود. با ایجاد رنگ در نمونه انتقال آن با اطمینان بیشتری انجام می­گردد. رنگ­های مورد استفاده در بافر راهنما خود نیز باردار شده و همراهDNA به سمت آند حرکت می­نمایند بنابر این میزان حرکت DNA قابل پیش ­بینی می­ شود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

سرعت حرکت DNA نسبت مستقیم با ولتاژ مورد استفاده دارد که البته این نسبت خطی نیست. ژل­ها معمولا در میدان الکتریکی V/cm2 ١٠-۴ الکتروفورز می­شوند. در اینجا منظور از سانتی متر فاصله میان دو الکترود ژل است.
با بهره گرفتن از مارکر استاندارد، اندازه مورد نظر محصول PCR، قابل بررسی و ارزیابی است. پس از پایان الکتروفورز می­توان ژل را در ژل داک قرار داد و به کمک نور UV رنگ فلورسنت در محلی که باندهای DNA قرار دارند آنها را تشخیص داد.
٣-۵: آنالیز آماری
به منظور تفسیر نتایج به دست آمده ازتحقیقات آزمایشگاهی، پارامترهای کمی (عددی) مورد نیاز است. در این تحقیق با بهره گرفتن از نرم افزارSPSS آزمون‌های آماری(χ²) Chi-Square و در صورت نیاز آزمون Odd Ratio (OR) انجام گرفت و همچنین پارامترهایی مانند P- valueو (CI) Confidence Intervalنیز تعیین می شود، که در بخش بعدی در مورد هر یک از پارامترهای فوق توضیحاتی داده شده است.
آزمون Chi-Square: از این آزمون آماری به منظور بررسی مورد تایید بودن نتایج مشاهده شده استفاده می‌شود. در واقع نتایج این آزمون نشان دهنده‌ وجود یا عدم وجود اختلاف در نسبت فاکتور خطر مورد نظر بین گروه ­های مورد مطالعه می‌باشد.
P-value: این پارامتر معنی­دار بودن یا نبودن نتایج را از نظر آماری نشان می‌دهد. در واقع P-value میزان خطایی است که مرتکب می‌شویم. در صورتی که میزان ٠۵/٠≤ Pباشد، نتایج به دست آمده معنی­دار خواهند بود.
آزمون Odd Ratio: این آزمون که به طور گسترده در مطالعات اپیدمولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد، میزان تأثیر یک فاکتور خطر احتمالی در بروز یک بیماری خاص را نشان می‌دهد. اما برای تفسیر OR بدست آمده از آزمون، نیاز به محاسبه­ی پارامتر CI یا فاصله­ی اطمینان است که مقدار این پارامتر به صورت یک بازه عددی نمایش داده می­ شود. تنها هنگامی که میزان OR بزرگ‌تر از یک باشد و حداقل بازه‌ی CI هم یک باشد، می‌توان فاکتور خطر پیشنهاد شده را به عنوان یک فاکتور خطر موثر در بروز بیماری در نظر گرفت.
فصل چهارم:
نتایج
مشخصات افراد شرکت کننده در مطالعه
در این تحقیق از دو گروه ، گروه اول که شامل ۵٠ فرد با بیماری آلزایمر اسپورادیک (دیررس) از مرکز سالمندان نورسته بودند و گروه دوم شامل ۵٧ فرد سالم بودند که به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شدند.
١- ۴: تجزیه و تحلیل آماری برای پلی مورفیسم (G/A) ٢۴٢۵۵٧rs ژن MAPT
١-١-۴: مقایسه ژنوتیپ های پلی مورفیسم (G/A) ٢۴٢۵۵٧rs ژن MAPT در دو گروه بیمار و سالم
همانگونه که در جدول پایین مشاهده می شود ژنوتیپ های مربوط به پلی مورفیسم (G/A) ٢۵۵٧٢۴ rs در ۵٠ نفر فرد بیمار و ۵٧ نفر فرد سالم ،با یکدیگر مقایسه شدند. با توجه به وجود دو آلل برای این ژن ، سه ژنوتیپ وجود داشت که فراوانی ژنوتیپ نوع نرمال ،هتروزیگوت و موتانت (AA, ،AG ,GG,)در گروه بیماران و شاهد به ترتیب (١۶،٣٢،٢) و (٣٢ ،٢۴ ،١) می­باشد .(در این مقایسه P-Value کمتر از ۵ ٠/٠ معنادار در نظر گرفته شد.)
جدول ١-١-۴: بررسی توزیع ژنوتیپ­ها در دو گروه بیمار و کنترل

گروه تحت مطالعه

ژنوتیپ

بیمار

کنترل

کل

OR

۹۵% CI

P-Value

AA

(٣٢ %) ١۶

٣٢(۵۶ %/١)