۲- رونشین حذف شد و رسوب آن در ۳۵۰ میکرولیتر بافر STET (جدول ۳-۱) حل شد.
۳- ۵/۱۲ میکرولیتر لیزوزیم (mg/ml 20 در ۸ mM Tris-HCl, pH= 10) افزوده شد. آمیخته یک دقیقه در آب جوش گرما داده شد.
۴- لوله ها به مدت ۱۵ تا ۳۰ دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شد. رسوب به دست آمده به کمک خلال دندان حذف شد.
۵- ۴۰ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار (۵(pH= و ۲۲۰ میکرولیتر ایزوپروپانول سرد به محصول افزوده شده و به آرامی آمیخته شد. سپس به مدت ۱۰ دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شد.
۶- رونشین به دست آمده حذف و رسوب آن با ۵۰۰ میکرولیتر اتانول ۸۰ درصد شستشو شد.
۷- لوله ها با بهره گرفتن از دستگاه تغلیظ کننده^[۵۳] مدل ۵۳۰۱ شرکت اپندورف خشک شدند و رسوب به دست آمده در ۳۰ میکرولیتر آب مقطر گندزدایی شده حاوی ۱/۰ درصد RNase حل شد.

۳-۴-۳- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباکتریوم برای انتقال ژن به میخک

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در این پژوهش از قطعه های برگ، گلبرگ و یا پینه ارقام ’Rendz-Vous ‘ و ’Panamera‘ میخک از گیاهان با عمر ۷ تا ۸ هفته برای تهیه ریزنمونه استفاده شد. برای گندزدایی سطحی ریزنمونه های برگ و یا گلبرگ، این ریزنمونه ها به مدت ۴۵ ثانیه در اتانول ۷۰% و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در هیپوکلریت سدیم ۱۰% قرار داده شدند و در پایان سه بار با آب مقطر گندزدایی شده شستشو شدند. ریزنمونه ها با بهره گرفتن از پنس و اسکالپل گندزدایی شده به قطعه­های ۳ تا ۴ میلی متری تقسیم شدند. سپس از این قطعه­های به عنوان ریزنمونه برای مایه زنی با اگروباکتریوم استفاده شد. برای آماده سازی باکتری برای انتقال ژن سویه مورد نظر اگروباکتریوم به مدت یک شب در محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامیسین (mg/ml 50) و ریفامپیسین (mg/ml 50) کشت و در دمای ۲۸ درجه سلسیوس قرار داده شد. میزان جذب این سوسپانسیون در nm600 با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد.
سپس سوسپانسیون باکتری به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سلسیوس در rpm 3500 سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ مایع رویی حذف گردید و به رسوب به دست آمده ml10 محیط کشت MS مایع (محیط مایهزنی) افزوده شد.

۳-۴-۴- پیش آماده سازی ریزنمونه ها

ریزنمونه های برگ و یا گلبرگ برای پیش آماده سازی روی محیط کشت MS نیم غلظت دارای ۱ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D، ۳۰ گرم در لیتر سوکروز و ۸ گرم در لیتر آگار با ۷/۵ = pH به مدت ۷۲ ساعت و در شرایط تاریکی قرار گرفتند.

۳-۴-۵- روش کار انتقال ژن به گیاه

پس از رشد باکتری در تاریکی و در دمای ۲۸ درجه سلسیوس چگالی نوری باکتری در nm600 اندازه گیری شد. برای بهینه کردن عوامل مؤثر در انتقال ژن، سه غلظت باکتری دارای چگالی نوری ۵/۰، ۸/۰ و ۱ در ۶۰۰ نانومتر در این آزمایش مورد بررسی قرار گرفت. تعداد شاخساره های تراریخت ایجاد شده در هر تیمار محاسبه و تجزیه و تحلیل شد. سپس ریزنمونه ها در سوسپانسیون اگروباکتریوم به مدت ۲۰، ۳۰ تا ۴۰ دقیقه فرو برده شده و در شیکر انکوبیتور^[۵۴] با دور آرام قرار داده شدند و پس از گذشت زمان لازم روی کاغذهای صافی که از پیش گندزدایی شده بودند قرار داده شده تا خشک شوند و سپس به صورت افقی روی محیط هم کشتی بدون آنتی بیوتیک به مدت ۲، ۳ و ۴ روز در شرایط تاریکی کشت شدند. سپس ریزنمونه ها با سفاتاکسیم با غلظت ۲۵۰ میلی گرم در لیتر شستشو داده شد تا باکتری ها از روی سطح ریزنمونه ها حذف شوند. سپس روی کاغذ صافی گندزدایی شده قرار گرفته تا خشک شوند. در مرحله بعد این ریزنمونه ها به یک محیط کشت گزینشگر حاوی عوامل گزینشگر مناسب منتقل شدند. محیط گزینش دارای نمک های MS، ویتامین ها، ۳۰ گرم در لیتر سوکروز، ۸ گرم در لیتر آگار، ۱۵۰ میلی­گرم در لیتر کانامیسین و ۴۰۰ میلی گرم در لیتر سفاتاکسیم به همراه تیمار تنظیم کننده های رشد مشابه محیط هم کشتی بود. ریزنمونه ها پس از انتقال به محیط کشت گزینش، در دمای ۲۸ تا ۳۰ درجه سلسیوس در شرایط ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی قرار داده شدند.

۳-۴-۶- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت

پس از هم کشتی، ریزنمونه ها با آنتی بیوتیک سفاتاکسیم با غلظت ۲۵۰ میلی گرم در لیتر شستشو داده شده و روی کاغذ صافی گندزدایی شده قرار گرفتند تا خشک شوند و به محیط کشت باززایی شاخساره I‌ منتقل شدند. پتری دیش ها در دمای ۲۸ درجه سلسیوس و روشنایی با دوره نوری ۱۶ ساعته قرار داده شدند. پس از گذشت ۳ تا ۵ هفته ریزنمونه ها به محیط کشت باززایی شاخساره II منتقل شدند. شاخساره ها از انتهای برش ۷ تا ۹ هفته پس از هم کشتی ایجاد شدند. شاخساره های باززایی شده با انجام آزمون GUS از نظرانتقال ژن مورد نظر، مورد بررسی قرار گرفتند. شاخساره هایی که سنجش GUS آن ها منفی بود به عنوان ناتراریخت شناخته شدند که به طور معمول شاخساره های گریخته^[۵۵] نامیده می شوند.
شاخساره های تراریخت به محیط کشت ریشه زایی انتقال داده شدند و در شرایطی که پیش تر بیان شد قرار گرفتند. حضور ژن uidA در گیاهان تراریخت با روش PCR و به کمک آغازگرهای اختصاصی که قطعه ۴۲۵ جفت بازی را ایجاد می کنند، بررسی شد.

۳-۴-۷- استخراج DNA از بافت های گیاهی با بهره گرفتن از محلول CTAB

استخراج DNA از نمونه­های گیاهی با بهره گرفتن از روش CTAB (جدول ۳-۲) انجام شد (سام بروک و راسل، ۲۰۰۱). برای استخراج DNA ژنومی به دلیل اندازه بزرگ بایستی به گونه ­ای از سلول استخراج شود که تا حد امکان حداقل صدمه یا شکستگی به آن وارد شود. علاوه بر آن ترکیبات فنلی موجود در دیواره سلول گیاهی در حین استخراج DNA به درون محلول استخراج شده وارد می­شوند. این ترکیبات فنولی در مراحل بعدی دستورزی DNA اعم از PCR و هضم آنزیمی مزاحمت ایجاد می­ کنند. لذا در استخراج DNAی ژنومی بایستی از روشی استفاده شود که در وهله ی اول DNA ژنومی سالم بدست آید و در مرحله دوم ترکیبات فنولی تا حد امکان در محلول استخراج شده حضور نداشته باشند. از این رو از روش CTAB برای استخراج DNA استفاده شد (جدول ۳-۲). ترکیب اصلی در این روش یک ماده شوینده به نامCethyltrimethylammonium Bromide(CTAB) N,N,N, می­باشد. این ماده افزون بر دارا بودن خاصیت شویندگی با دارا بودن بار­های مثبت، اطراف مولکول­های DNA را که بار منفی دارند پوشانده که این عمل DNA سلولی را تا حد زیادی از سایر ترکیب ها جدا
می کند.
۱- بافر استخراج CTAB برای ۵۰ ml
جدول ۳-۳- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی