Inoculums calibration

۵/۰ مک فارلند

تعداد دیسک ها و فاصله آن ها از هم

۶-۵ عدد در پلیت با قطر ۱۰۰-۹۰ میلیمتر و فاصله مرکز یک دیسک با دیسک دیگر ۲۴ میلیمتر

زمان بین کشت و گذاشتن دیسک­ها

کمتر از ۱۵ دقیقه

۶-۲-۳- نکات مورد توجه در انجام آزمایش آنتی بیوگرام

آزمایش در زیر هود و در کنار شعله انجام شد.
قبل از بردن باکتری بر روی محیط “مولر هینتون” از عدم رشد یا وجود باکتری بر روی آن اطمینان حاصل گردید.
از سواب استریل برای کشت بر روی محیط استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
هنگام گذاشتن دیسک ها بر روی محیط آن ها را بر روی محیط کمی فشار داده و از جا به جا کردن پرهیز گردید.
هر بار قبل از گذاشتن دیسک ها توسط پنس بر روی محیط، پنس شعله داده شد.
پلیت های کشت داده شده حاوی دیسک آنتی بیوگرام به صورت وارونه در انکوبانتور قرار گرفت
از پلیت های شفاف و بدون کدورت برای سهولت خواندن نتایج استفاده گردید.
دستگاه انکوباتور قبل از گذاشتن پلیت ها و شیشه ها درون آن از لحاظ عمل چک گردید.
در پایان کار پلیت ها و لوله های حاوی باکتری برای جلوگیری از گسترش آلودگی جمع آوری و درون دستگاه اتوکلاو استریل شدند.

۷-۲-۳- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام

در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده شد.
برای اندازه گیری امتداد خط کش از وسط دیسک عبور می‌کرد.
در ارتباط با هر دیسک قطر هاله اندازه‌گیری شد.
اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم وجود داشت از همان جا تا دیسک اندازه‌گیری گردید نه کل هاله.
دیسک‌ها و هاله‌ها در زیر نور بررسی شد.

۸-۲-۳- بررسی حضور مقاومت‌های چند گانه

جهت ارزیابی وجود مقاومت های چندگانه در این بررسی، وجود مقاومت به آنتی بیوتیک شاخص در هر یک از خانواده های آنتی بیوتیکی مهم در نظر گرفته شد. بدین منظور ۷ آنتی بیوتیک جنتامایسین، سیپروفلوکساسین، آمپی سیلین، تتراسیکلین، کلرامفنیکل، تریمتوپریم/سولفا و کلیسیتین بعنوان آنتی بیوتیک های شاخص انتخاب شدند (ماجیوراکوس و همکاران، ۲۰۱۲). مقاومت های چند گانه به سه دسته مقاومت آنتی‌بیوتیکی به چندین دارو^[۴۶]، مقاومت گسترده آنتی بیوتیکی^[۴۷] و مقاومت کامل آنتی بیوتیکی^[۴۸] طبقه بندی شدند که در آن مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی یا MDR شامل جدایه هایی می شد که حداقل به یک آنتی بیوتیک شاخص در ۳ یا تعداد بیشتری از خانواده های آنتی بیوتیکی مقاوم بودند. مقاومت گسترده آنتی بیوتیکی یا XDR در مورد جدایه هایی بکار رفت که حداقل به یک آنتی بیوتیک شاخص در همه خانواده های آنتی بیوتیکی باستثنای یک و یا دو خانواده آنتی بیوتیکی مقاوم بودند. اصطلاح مقاومت آنتی بیوتیکی کامل یا PDR در مورد جدایه هایی استفاده شد که به همه آنتی بیوتیک های شاخص در تمامی گروه های آنتی بیوتیکی مقاوم بودند (ماجیوراکوس و همکاران، ۲۰۱۲).

۹-۲-۳- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی

استخراج DNA به روش جوشاندن انجام گرفت (سامبوروک و همکاران، ۱۹۸۹). در این روش پس از خالص سازی اولیه، چند کلنی مجزای صورتی رنگ از روی محیط مک کانکی برداشته شده و در میکروتیوب های ۵/۱ میلی لیتری حاوی ۲۵۰ میکرو لیتر بافر شستشو ^[۴۹]حل شدند. بافر حاوی کلنی های باکتری به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت ۵ دقیقه در آبجوش ۱۰۰ درجه ساتی گراد قرار داده می شد. پس از این مرحله میکروتیوب های حاوی کلنی های جوشیده شده به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه سانتریفیوژ با دور rpm 6000 سانتریفیوژ شده و پس از اتمام کار مایع رویی جمع آوری شده و به عنوان منبع DNAاستفاده گردید. DNA های استخراج شده تا زمان انجام آزمایش PCR در فریزر ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
جدول ۶-۳: اطلاعات نمونه های کارشده ، گرفته شده از مزارع گوشتی شهرستان شیراز

مرحله نمونه گیری

ایزوله های E. coli

محل جداسازی (فارم)

شماره نمونه
(کد یخچالی)

مرحله اول

۳-۱-۳

شیراز

۱۸