این روش برای اولین بار در سال ۱۹۸۹ توسط تانکسلی و همکاران ارائه شد. برای انجام واکنش PCR، از دستورالعمل و مواد زیر استفاده می­ شود. تمامی مواد مورد استفاده برای PCR، به­جز DNA و آب مقطر دوبار تقطیر شده، به صورت تیوب­های آماده تجاری و محلول بودند که از شرکت سیناژن تهیه شدند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
. غلظت بهینه مواد بکار رفته در واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم ۲۵ میکرولیتر شامل یک و نیم میکرولیتر از کلرید منیزیم ۵۰میلی مولار ، ۵/۲ میکرولیتر بافر ۱۰x، ۱ میکرولیتر از پرایمر (۱۰ پیکومول) ، ۱/۰ میکرولیتر از dNTP (10 میلی مولار)، ۲/۰ میکرولیتر آنزیم Taq DNA polymerase، ۱ میکرولیتر از DNA نمونه های بیماران و گروه کنترل می باشد.
۳-۷-۱ طراحی پرایمرها اختصاصی برای تعیین SNP
پرایمرهای مورد نظر جهت تکثیر قطعاتDNA طراحی و از کمپانی BioNeer کشور کره‌جنوبی خریداری شد. توالی پرایمرهای طراحی شده برای قطعات مورد نظر در جدول ۲-۳ آمده است.
جدول ۲-۳ توالی پرایمرهای مستقیم و معکوس

۳-۷-۲ dNTPs
dNTP ها از شرکت سیناژن تهیه شدند که حاوی ۵۰۰ میکرولیتر از محلول ترکیب شده نوکلئوتیدهای dGTP و dTTP و dATP و dCTP با غلظت ۱۰ میلی­مول بودند. نگهداری آنها در فریزر ۲۰- صورت گرفت
۳-۷-۳ کلرید منیزیم(MgCl₂)
محلول کلرید منیزیم از شرکت سیناژن تهیه شد. این محلول با غلظت ۵۰ میلی­مول و بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار گرفت. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۰ میکرولیتری، ۵/۱ میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
۳-۷-۴ بافر واکنش PCR
بافر واکنش از شرکت سیناژن تهیه شد. بافر واکنش حاوی ۵۰۰ میلی­مول کلرید پتاسیم و ۲۰۰ میلی­مول تریس- اسید کلریدریک با pH=8 بود. غلظت این محلول به صورت ۱۰X می­باشد و بدون رقیق کردن در واکنش PCR استفاده می­ شود. بافر واکنش نیز در فریزر ۲۰- نگهداری شده و قبل از استفاده ذوب شده و پس از استفاده دوباره به فریزر ۲۰- منتقل می­ شود. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۰ میکرولیتری، ۵/۲ میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
۳-۷-۵ آنزیم Taq Polymerase
این آنزیم بطور مستقیم در واکنش PCR مورد استفاده قرار می­گیرد. نگهداری این آنزیم در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد است و برای استفاده بایستی بر روی یخ قرار گیرد. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۰ میکرولیتری ۲/۰ میکرولیتر استفاده می­ شود.
۳-۷-۶ آب دوبار تقطیر شده استریل
از آب مقطرهای درون شیشه­های آمپول که به صورت استریل و دوبار تقطیر شده عرضه می­گردد، استفاده می­ شود.
۳-۸ راه اندازی واکنش PCR

1. 1. مخلوط فوق را در میکروتیوب­های ۲۰۰ میکرولیتری که از قبل نامگذاری و شماره گذاری شده ­اند، ریخته ­شود. به این صورت که در هر تیوب ۲۴ میکرولیتر از مخلوط واکنش ریخته و سپس بر اساس نامگذاری تیوب­ها به هرکدام ۱ میکرولیتر از DNA موردنظر اضافه ­گردد.

1. در مرحله آخر و بعد از بستن درپوش میکروتیوب­ها آنها را تکان داده تا هوای اضافی خارج شود و سپس درون خانه­های دستگاه PCR چیده و سپس دستگاه طبق برنامه­ای که به آن داده می­ شود، روشن ­شود.